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基于翻譯后修飾的分泌蛋白質組時空圖譜揭示衣康酸修飾激活的酪氨酸激酶FYN

《Nature Communications》：Spatiotemporal profiling of modification-specific proteome secretion uncovers an itaconation-activated tyrosine kinase

【字體：大中小】 時間：2025年12月05日 來源：Nature Communications 15.7

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　　本研究針對巨噬細胞分泌蛋白質組的翻譯后修飾(PTM)調控機制這一前沿問題，開發了PTM-based secretome profiling(PBSP)新技術。研究人員通過生物正交探針標記、FISAP富集和DIA質譜分析，首次繪制了衣康酸修飾(itaconation)分泌蛋白的時空動態圖譜，發現818個itaconated分泌蛋白，并證實酪氨酸激酶FYN的Cys239位點衣康酸修飾可增強其激酶活性。該研究為理解PTM在細胞間通訊中的調控功能提供了全新視角，發表于Nature Communications。

在免疫學研究領域，巨噬細胞作為重要的免疫哨兵，通過分泌大量信號蛋白來協調復雜的免疫應答過程。這些分泌蛋白中近半數缺乏信號肽，需要通過外泌體等非常規途徑分泌到細胞外空間。然而，目前對調控這些蛋白分泌的分子機制，特別是翻譯后修飾(PTM)在其中發揮的作用，了解甚少。

與此同時，巨噬細胞在病原體感染或腫瘤微環境中會產生大量衣康酸(itaconate)，這種免疫調節代謝物能夠通過其α,β-不飽和羧酸結構共價修飾蛋白質半胱氨酸殘基，這一過程被稱為衣康酸修飾(itaconation)。已知的衣康酸修飾靶點包括KEAP1、ALDOA、JAK1等重要免疫調節因子，它們參與調控NRF2抗氧化通路、糖酵解和細胞焦亡等關鍵過程。然而，現有研究主要聚焦于細胞內蛋白質的衣康酸修飾，對于分泌蛋白的衣康酸修飾及其在細胞間通訊中的作用仍知之甚少。

更令人遺憾的是，盡管近年來發展了TransitID等時空分辨蛋白質組技術，能夠無偏倚地繪制蛋白質運輸和分泌圖譜，但這些方法缺乏足夠的分辨率來研究特定修飾形式的蛋白質分泌。PTM如磷酸化、糖基化和酰化已知能夠調控蛋白質運輸和分泌，但現有研究多集中于單個蛋白或通路，迫切需要能夠大規模、無偏倚分析PTM調控蛋白質分泌的方法。

針對這一技術瓶頸，清華大學秦煒團隊與中國藥科大學莊慎天團隊合作，在Nature Communications上發表了題為"Spatiotemporal profiling of modification-specific proteome secretion uncovers an itaconation-activated tyrosine kinase"的研究論文。該研究開發了一種名為PTM-based secretome profiling(PBSP)的新方法，能夠精確追蹤攜帶特定PTM的蛋白質分泌過程。

研究人員采用的技術方法主要包括：利用生物正交探針(如ITalk)在活細胞中進行脈沖標記；通過離心柱親和純化(FISAP)平臺進行低樣本量下的高效富集；結合數據非依賴采集(DIA)質譜技術提高檢測靈敏度和重現性；使用外泌體抑制劑GW4869區分不同分泌途徑；通過點突變和體外修飾實驗驗證特異性修飾位點；利用LPS刺激和IRG1基因敲除細胞模型驗證內源性調控機制。

Establishment of PBSP

研究團隊首先以衣康酸修飾為概念驗證體系，利用衣康酸-炔烴(ITalk)探針在活體巨噬細胞中標記衣康酸修飾蛋白。通過脈沖標記2小時后洗脫探針，再在無血清培養基中追蹤12小時，成功實現了分泌蛋白中衣康酸修飾的時空動態分析。實驗證實，ITalk標記過程不影響衣康酸代謝，且能夠在分泌組中檢測到與細胞內明顯不同的標記模式。

Development of a streamlined proteomic workflow for PBSP

為解決傳統數據依賴采集(DDA)質譜方法的隨機數據丟失問題，研究團隊建立了FISAP與DIA質譜聯用的工作流程。這一優化方案顯著提高了檢測靈敏度和重現性，在三個生物學重復中顯示出高度相關的富集比率。最終從巨噬細胞分泌組中鑒定出818個ITalk標記的衣康酸修飾分泌蛋白。

Analysis of ITalk-labeled secreted proteins

數據分析顯示，鑒定到的衣康酸修飾分泌蛋白中70%為已知分泌蛋白，且與既往細胞內衣康酸修飾圖譜高度重疊。KEGG通路分析表明這些蛋白富集于蛋白酶體、碳代謝和氨基酸生物合成等通路，而新發現的衣康酸修飾蛋白則主要與溶酶體、核糖體、糖降解和COVID-19相關。值得注意的是，研究鑒定到多個關鍵免疫相關蛋白，如RIG-I、MAPK1和MAPK3，均為首次被發現同時經歷衣康酸修飾和分泌。

Identification of exosome-dependent ITalk-labeled secreted proteins

通過使用外泌體抑制劑GW4869，研究團隊進一步鑒定了447個外泌體依賴的衣康酸修飾分泌蛋白。這些蛋白中包括已知的功能性衣康酸修飾底物GSDMD，其通過外泌體途徑分泌，提示衣康酸修飾可能進一步影響其在受體細胞中的功能活性。基因本體(GO)分析顯示這些蛋白富集于蛋白質運輸、折疊和穩定等生物過程。

Itaconation of FYN at Cys239 promotes FYN kinase activity

在新型衣康酸修飾蛋白中，研究團隊重點關注了酪氨酸激酶FYN。生化驗證證實FYN確實發生衣康酸修飾，質譜分析鑒定出六個潛在修飾半胱氨酸位點。通過點突變實驗，最終確定SH2結構域中的Cys239是FYN的主要衣康酸修飾位點。值得注意的是，這一修飾顯著抑制了FYN Tyr531的磷酸化，而Tyr531是FYN的抑制性磷酸化位點，表明衣康酸修飾增強了FYN激酶活性。在LPS刺激的巨噬細胞中，內源性衣康酸的積累同樣導致FYN Tyr531磷酸化水平下降，且這一效應在IRG1敲除細胞中消失，證實了衣康酸在此過程中的必要性。

Identification of succinated secreted proteins via PBSP

為展示PBSP平臺的普適性，研究團隊還將該方法應用于琥珀酸修飾(succination)的分泌蛋白分析。使用富馬酸-炔烴探針，鑒定到與衣康酸修飾幾乎不重疊的琥珀酸修飾分泌蛋白，這些蛋白主要富集于補體和凝血級聯、谷胱甘肽代謝和蛋白酶體功能等通路，表明不同PTM對底物分泌存在特異性調控機制。

該研究的創新性在于首次開發了能夠精確追蹤PTM特異性蛋白質分泌的技術平臺，揭示了衣康酸修飾在調控蛋白質分泌和細胞間通訊中的全新功能。特別是發現FYN激酶的衣康酸修飾增強其活性，并通過外泌體途徑分泌，為理解腫瘤微環境等病理條件下免疫細胞與靶細胞間的通訊機制提供了新視角。

研究也存在一定局限性，如化學探針與天然PTM在結構上存在差異，可能影響其功能性和分泌過程；當前技術尚無法解析細胞內PTM介導的運輸過程。未來開發細胞器特異性標記策略將有助于在更高分辨率下揭示PTM調控的細胞內蛋白質動態。

總之，這項研究不僅提供了強大的技術平臺PBSP，還創建了寶貴的衣康酸修飾和琥珀酸修飾分泌蛋白資源，為深入探索PTM在細胞間通訊中的功能奠定了基礎。這些發現對于理解免疫代謝調控、腫瘤微環境交流等生物學過程具有重要意義，也為相關疾病治療策略的開發提供了新思路。

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