細胞色素c氧化酶依賴性呼吸作用在T細胞活化、增殖及記憶形成中的核心機制研究

《Nature Communications》：Cytochrome c oxidase dependent respiration is essential for T cell activation, proliferation and memory formation

【字體： 大 中 小 】 時間：2025年12月05日 來源：Nature Communications 15.7

　　

當T細胞遇到抗原時，它們會啟動一場深刻的代謝革命，從靜息狀態迅速轉變為高度活躍的增殖狀態，以執行免疫防御任務。長期以來，科學界將目光聚焦于糖酵解的爆發式增強，認為這是驅動T細胞克隆擴張的主要動力。然而，作為細胞能量工廠的線粒體，其呼吸作用在這一關鍵過程中的具體角色卻籠罩在迷霧之中。線粒體氧化磷酸化不僅產生ATP，還涉及活性氧生成、凋亡調控等復雜信號傳導，但呼吸功能與質子泵送功能的貢獻究竟孰輕孰重，始終是未解之謎。

來自美國國立衛生研究院國家人類基因組研究所的Tatiana N. Tarasenko、Emily Warren等研究人員在《Nature Communications》上發表的最新研究，通過巧妙的遺傳學操作，成功將呼吸功能與質子泵送功能解耦，揭示了細胞色素c氧化酶依賴性呼吸對T細胞活化、增殖和記憶形成不可或缺的作用。

研究人員首先構建了T細胞特異性缺失COX10基因的小鼠模型（TCox10^-/-），該基因編碼的酶是細胞色素c氧化酶關鍵輔基血紅素a合成所必需的。這些T細胞因此缺乏完整的復合物IV功能，線粒體呼吸嚴重受損。為了特異性恢復呼吸而不伴隨質子泵送，研究團隊引入了一種來自玻璃海鞘的替代氧化酶AOX。AOX能夠直接將電子從泛醌傳遞給氧氣生成水，繞過復合物III和IV，且不泵送質子。通過雜交育種，他們獲得了T細胞同時缺失Cox10但表達AOX的小鼠模型（TCox10^-/-/Aox）。

研究發現，AOX的表達能夠有效恢復COX缺陷T細胞的氧消耗速率，盡管細胞色素c氧化酶本身的活性依然缺失。轉錄組分析顯示，AOX重塑了基因表達譜，糾正了與細胞周期、凋亡信號以及T細胞增殖分化相關的通路異常。在超微結構水平，COX缺陷導致的線粒體形態異常（如長度增加、數量減少）在AOX表達后得以逆轉，恢復至類似野生型的結構。線粒體膜電位（ΔΨm）的失衡和活性氧的升高也被AOX顯著改善，NAD⁺/NADH比率恢復正常，表明氧化還原穩態得到恢復。

尤為重要的是，研究揭示了維持AOX介導的呼吸所必需的電子輸入來源。通過使用特異性抑制劑，他們發現復合物I的活性對于維持AOX表達細胞的膜電位和ATP合成至關重要。抑制復合物I會導致膜電位急劇下降和ATP合成顯著減少。復合物II和二氫乳清酸脫氫酶的抑制也有影響，但程度較輕，表明它們主要通過維持泛醌庫的還原狀態來支持電子流。穩定同位素示蹤實驗進一步顯示，AOX表達恢復了TCA循環的動態，使COX缺陷細胞中異常的谷氨酰胺代謝向野生型水平正常化。

一個出乎意料的發現是，盡管AOX恢復了線粒體呼吸和氧化還原平衡，糖酵解活性在TCox10^-/-/Aox細胞中依然維持在較高水平。細胞外酸化率和乳酸產量與未 rescued 的COX缺陷細胞相當。然而，糖酵解的上調并非由低氧誘導因子1α驅動，因為其蛋白水平在AOX表達后已恢復正常。這提示存在一種不依賴于HIF1α的、可能與改變了的氧化還原信號相關的機制，持續促進了糖酵解通量。

在功能層面，AOX介導的呼吸顯著挽救了COX缺陷T細胞的存活。激活后72小時，TCox10^-/-/Aox T細胞的凋亡率顯著降低，Caspase 3、8、9的活化水平下降。RNAseq數據映射到KEGG凋亡通路顯示，AOX逆轉了COX缺陷細胞中Fas、FasL等外源性凋亡通路關鍵分子的上調。體外功能實驗證實，AOX表達使T細胞增殖能力恢復至野生型水平，甚至在疊氮化鈉抑制內源性COX后仍能持續增殖。這種增殖依賴于復合物I、II和DHODH的電子輸入。CD4⁺T細胞能夠有效地分化為Th1和Th17效應亞群，細胞毒性CD8⁺T細胞也恢復了顆粒酶表達和靶細胞殺傷能力。

體內實驗進一步驗證了AOX的功能拯救作用。在適應性轉移模型中，TCox10^-/-/Aox T細胞在抗原刺激后表現出比COX缺陷細胞顯著改善的增殖能力。在流感病毒感染模型中，預先免疫X-31流感病毒后再用PR8病毒攻擊，TCox10^-/-/Aox小鼠能夠產生與野生型相當水平的病毒特異性記憶CD8⁺T細胞（針對NP_366-374和PA_224-233表位），并且肺部的病毒載量顯著低于COX缺陷小鼠，表明其抗病毒免疫功能得到實質性恢復。

本研究的關鍵技術方法包括：利用條件性基因敲除和轉基因小鼠模型構建T細胞特異性COX10缺失且表達AOX的基因工程鼠；通過細胞培養和激活實驗模擬T細胞免疫應答；應用海馬能量代謝分析系統測量氧消耗速率和細胞外酸化率；采用流式細胞術進行細胞表型、活性、凋亡、線粒體功能（膜電位、活性氧、ATP）等多參數檢測；運用透射電子顯微鏡觀察線粒體超微結構；通過RNA測序進行轉錄組學和加權基因共表達網絡分析；利用氣相色譜-質譜聯用進行¹³C標記的葡萄糖和谷氨酰胺代謝流分析；以及建立體內流感病毒感染模型和適應性T細胞轉移模型評估免疫應答。

研究結果部分通過系列實驗證實：AOX表達可逆轉COX缺陷導致的轉錄組異常，恢復細胞周期、凋亡和分化相關通路；AOX改善線粒體結構和氧化還原穩態，糾正膜電位和活性氧失衡；AOX-MR揭示復合物I是維持膜電位和ATP合成的關鍵電子輸入源；盡管呼吸恢復，糖酵解在AOX拯救的細胞中仍持續活躍，提示存在不依賴于HIF1α的調控機制；AOX-MR通過抑制內外源性凋亡通路顯著改善T細胞存活；AOX-MR支持T細胞體外增殖、效應/記憶分化和細胞毒性功能；體內實驗證明AOX-MR可部分恢復T細胞增殖能力，并完全恢復抗病毒免疫記憶和病毒清除能力。

綜上所述，這項研究確立了線粒體呼吸作用本身，而非其偶聯的質子泵送功能，是T細胞成功活化和功能執行的必要條件。通過AOX這一分子工具，研究成功解析了呼吸作用在T細胞代謝重編程中的獨立貢獻，揭示了上游電子輸入（尤其是復合物I）對維持呼吸功能的關鍵性。這不僅深化了對T細胞免疫代謝的理解，也為探索線粒體功能障礙相關免疫疾病的治療策略提供了新的思路和靶點。研究表明，線粒體呼吸是協調T細胞命運決定的核心樞紐，其作用遠超出簡單的能量供應，涉及復雜的信號網絡整合。