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同步靈敏定量生物樣本中蛋白質與低分子量過硫化物、多硫化物及H2S的新方法及其生物學應用

《Nature Communications》：Simultaneous and sensitive quantification of protein and low molecular weight persulfides, polysulfides and H2S in biological samples

【字體：大中小】 時間：2025年12月05日 來源：Nature Communications 15.7

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　　本研究針對生物體系中H2S、過硫化物(RSS-)和多硫化物(RS(S)nS-)難以同步準確定量的技術瓶頸，開發了基于硫原子捕獲的LC-MS/MS方法。研究人員通過設計兩種互補的程序（A和B），利用碘乙酰胺-三苯基膦(IAM-TPP)衍生物分別捕獲H2S、RSS-/RS(S)nS-的末端硫原子和內部硫原子，實現了在同一個樣本中同步檢測這些活性硫物種。該方法靈敏度達到fmol級別，并成功應用于從分離蛋白質到離體組織等多種生物體系，揭示了缺血條件下H2S水平升高但總過硫化物未增加，而氧化應激與H2S共同作用可誘導過硫化物形成的新現象。該研究為探索活性硫物種的生理病理功能提供了強大工具。

在生命科學領域，氫硫化(H₂S)曾長期被視為有毒的環境污染物和代謝副產物，但近年來與一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)一起被確認為重要的生物活性分子。在生理pH條件下，H₂S(pK_a≈7)主要以氫硫陰離子(HS^-)形式存在，而其共軛酸可自由通過生物膜進入線粒體。H₂S可通過可逆修飾低分子量硫醇(LMwSH)和蛋白質硫醇(PrSH)形成過硫化物(RSS^-)和多硫化物(RS(S)_nS^-)，參與抗氧化防御和活性調控。然而，由于難以準確定量這些修飾，我們對其生物學意義的理解一直受限。

目前的研究方法存在諸多局限性：無法區分H₂S、RSS^-和RS(S)_nS^-；難以同時檢測這些物種；檢測靈敏度低；缺乏穩定同位素標記內標；樣本離體處理過程中的不穩定性導致捕獲物種不確定。這些限制嚴重阻礙了對活性硫物種生物學功能的深入探索。

為了解決這些問題，由Jan Lj. Miljkovic、Nils Burger、Chak Shun Yu等研究人員組成的團隊在《Nature Communications》上發表了題為“Simultaneous and sensitive quantification of protein and low molecular weight persulfides, polysulfides and H₂S in biological samples”的研究論文。他們開發了一套靈敏的LC-MS/MS方法，能夠同步定量檢測生物樣本中的H₂S、低分子量過硫化物(LMWSS^-)和蛋白質過硫化物(PrSS^-)及其多硫化物。

研究人員開發的關鍵技術方法包括：基于碘乙酰胺-三苯基膦(IAM-TPP)衍生物的硫原子捕獲策略，通過兩種互補程序（程序A和B）分別特異性捕獲不同活性硫物種；利用三苯基膦陽離子(TPP⁺)標記增強質譜檢測靈敏度；建立穩定同位素標記內標實現絕對定量；應用SP3磁珠技術處理蛋白樣本避免沉淀重懸步驟；采用標準添加法(SAM)克服組織樣本基質效應。研究樣本涵蓋純化蛋白、細胞裂解液、大鼠和小鼠的組織樣本（包括心臟、肝臟、腎臟和腦組織）以及離體Langendorff心臟灌流模型。

Trapping H₂S, RSS^-and RS(S)_nS^-as stable products

研究人員開發了一種硫原子捕獲方法，將目標硫原子納入可通過LC-MS/MS靈敏定量的診斷產物中。他們使用碘乙酰胺-三苯基膦(IAM-TPP)衍生物，利用RSS^-和RS(S)_nS^-的高親核反應性，與IAM-TPP反應生成包含末端硫原子的診斷產物。TPP⁺陽離子的固定正電荷大大增強了LC-MS/MS檢測的靈敏度。

在程序A中，RSS^-和RS(S)_nS^-與IAM-TPP反應生成碳酰胺甲基-TPP硫醚，同時封閉游離硫醇。該程序也將H₂S轉化為S(CAM-TPP)₂。用TCEP還原后，加入過量碘乙酰胺(IAM)從RSS-CAM-TPP和RS(S)_nS-CAM-TPP中釋放化學計量的CAM-S-CAM-TPP。因此，程序A生成兩種TPP標記的產物：來自RSS^-和RS(S)_nS^-末端S原子的CAM-S-CAM-TPP，以及來自H₂S的S(CAM-TPP)₂。

程序B用于平行定量RS(S)_nS^-的內部硫原子。首先用IAM烷基化RSH、RSS^-和RS(S)_nS^-，然后用TCEP還原同時用過量IAM-TPP捕獲，從RS(S)_nS^-的末端硫原子生成CAM-S-CAM-TPP，從所有內部硫原子生成S(CAM-TPP)₂。

通過應用程序A和B，研究人員可以生成診斷H₂S、RSS^-和RS(S)_nS^-末端S原子以及RS(S)_nS^-內部S原子的TPP產物。線性標準曲線使得兩種化合物在低fmol范圍內都能被靈敏檢測。

Quantification of persulfides and polysulfides on PrSH

研究人員首先使用圖1所示的程序A和B來定量純化蛋白質上的PrSS^-和PrS(S)_nS^-。他們使用了一種修飾的人硫氧還蛋白1(Trx1)，該蛋白包含鏈霉親和素結合蛋白(SBP)標簽且僅含單個Cys殘基。SBP標簽能夠與NeutrAvidin珠結合，便于用Na₂S₂處理，無需蛋白質沉淀和重懸。

用Na₂S₂處理暴露的硫醇應導致過硫化物和多硫化物形成。用Na₂S₂處理后使用程序A分析，導致CAM-S-CAM-TPP的濃度依賴性和可飽和生成，與Na₂S₂在Trx1上形成PrSS^-和PrS(S)_nS^-的檢測一致。用Na₂S₂處理后使用程序B分析也導致S(CAM-TPP)₂的劑量依賴性形成，與PrS(S)_nS形成一致。

用DTNB然后Na₂S處理結合的Trx1應僅生成PrSS^-，這導致通過程序A檢測到CAM-S-CAM-TPP，而通過程序B未檢測到S(CAM-TPP)₂。單獨使用Na₂S不會生成CAM-S-CAM-TPP。

研究人員還將該方法擴展到珠子上結合的蛋白質之外，分析了用MitoPerSulf處理的人重組Cofilin 1，該處理在Cys39和Cys139上形成過硫化物(PrSS^-)。用MitoPerSulf處理Cofilin 1后，通過程序A使用沉淀和重懸去除烷基化劑IAM-TPP，然后通過LC-MS/MS分析檢測到CAM-S-CAM-TPP，與Cofilin 1上PrSS形成一致。

研究人員還將單蛋白分析擴展到通過凍融和超聲處理人胚胎腎細胞(HEK 293)制備的細胞裂解液。裂解液用Na₂S₂或Na₂S處理，然后用IAM-TPP或IAM烷基化（程序A或B），然后吸附到混合疏水親水固體基質SP3珠上，便于蛋白質樣品處理而無需沉淀和重懸。珠吸附的蛋白質然后通過程序A處理生成CAM-S-CAM-TPP，通過程序B處理生成S(CAM-TPP)₂。用Na₂S₂處理導致PrSS和PrS(S)_nS的劑量依賴性形成，這可被TCEP逆轉，在未處理的細胞裂解液中未檢測到PrSS背景。

在天然條件下制備的小鼠心臟勻漿用Na₂S₂處理也通過相同程序導致PrSS和PrS(S)_nS形成。通過定量SP3珠上結合的硫醇和蛋白質，研究人員評估了可用蛋白質硫醇被Na₂S₂修飾的比例，顯示在這些條件下約3.5%的可用蛋白質硫醇被過硫/多硫化。

Quantification of persulfides and polysulfides on LMWSH

研究人員隨后將這些程序擴展到定量LMWSS^-。他們通過將GSH與DTNB孵育生成GS-TNB，然后通過添加Na₂S轉化為GSS^-，如兩個步驟中TNB釋放所示。然后將GSH與1當量DTNB反應，然后與1當量Na₂S反應，然后應用程序A并定量CAM-S-CAM-TPP。這顯示CAM-S-CAM-TPP形成，可通過用硫醇烷基化劑4-氯-7-硝基苯并呋喃(CNBF)預處理或在添加IAM-TPP前用過量TCEP處理來預防。當類似樣品通過程序B處理時，檢測到可忽略量的多硫化物（內部硫原子）。

將10μM GSH與0至1當量DTNB反應，然后與10μM Na₂S反應，然后應用程序A并定量[CAM-S-CAM-TPP]，顯示[CAM-S-CAM-TPP]隨著添加的DTNB量增加而增加，最高達1當量DTNB，表明該程序對增加的LMWSS^-有響應。缺乏Na₂S阻止了CAM-S-CAM-TPP形成，而過量Na₂S僅略微增加[CAM-S-CAM-TPP]。在這些條件下使用程序B評估RS(S)_nS^-顯示最小的S(CAM-TPP)₂形成，除非存在過量Na₂S，與其與現有過硫化物的反應一致。

將GSH與Na₂S₂孵育然后通過程序A顯示一些[CAM-S-CAM-TPP]形成，與多硫化物末端硫和任何存在的過硫化物的檢測一致。此外，應用程序B顯示S(CAM-TPP)₂生成，與內部硫原子多硫化物形成的檢測一致。因此，該方法可用于監測LMWSH上的過硫化物和多硫化物。GSH轉化為GSS^-的量范圍從0.4-20%，取決于使用的條件。

為了進一步評估LMWSS^-，研究人員隨后建立了GSS^-本身的直接LC-MS/MS測定法。由于GSH是體內最豐富的LMWSH，GSS^-可能是生物學背景中的主要LMWSS^-。該測定法的基礎是將GSS^-與IAM-TPP反應生成GSS-CAM-TPP，由于其帶正電荷的TPP MS標簽，可通過LC-MS/MS輕松靈敏檢測。這能夠針對其相應的氘代內標GSS-CAM-d₁₅TPP定量GSS^-。

使用這些直接測定法，研究人員顯示將GSSG與Na₂S孵育然后用IAM-TPP捕獲導致GSH（檢測為GS-CAM-TPP）和GSSH（檢測為GSS-CAM-TPP）形成。從GSSG和H₂S反應合成GSS^-的產率與先前報告一致。通過將GSH與0-3當量Na₂S₂反應然后用IAM-TPP捕獲生成GSSH，顯示Na₂S₂劑量依賴性GSH損失以及GSS^-積累。平行地，研究人員還使用程序A評估了這些樣品的LMWSS^-產生，顯示CAM-S-CAM-TPP形成濃度與GSS-CAM-TPP相似。在這些條件下，通過程序B評估也有一些多硫化物形成，通過程序A有S(CAM-TPP)₂形成，與H₂S形成一致。

在某些條件下過硫化物的末端烷基化導致過硫化物轉化為硫醚，伴隨硫原子丟失。盡管這種重排在使用大小與IAM-TPP相似的龐大烷基化劑時發生得少得多，但程序A中初始烷基化過硫化物任何轉化為硫醚都會人為減少定量的過硫化物量。研究人員通過量化GSS-CAM-TPP在TCEP存在下任何轉化為相應硫醚GS-CAM-TPP來評估這是否影響他們的方法。將GSS-CAM-TPP與0至10當量TCEP孵育并評估GS-CAM-TPP的產生。GSS-CAM-TPP與TCEP孵育30分鐘導致GSS-CAM-TPP損失與添加的TCEP量成比例，但沒有GS-CAM-TPP形成。因此，二硫鍵異構化 followed by desulfuration to a thioether does not affect our quantification of persulfides。因此，LMWSS^-可以通過程序A確定，平行地，GSS^-（體內可能的主要LMWSS^-）的濃度可以直接確定。

Tissue protein and LMW persulfide levels

研究人員隨后應用這些方法評估體內組織中由于RSS^-/RS(S)_nS^-和H₂S引起的末端S原子的穩態水平。為了捕獲這些短暫存在的物種，他們快速分離并速凍一組小鼠和大鼠組織。末端S的檢測僅需要程序A。初始勻漿中存在的H₂S通過第一個等分試樣中蛋白質沉淀后檢測S(CAM-TPP)₂來評估。第二個等分試樣用TCEP和IAM處理后通過蛋白質沉淀后測量CAM-S-CAM-TPP給出組織勻漿中存在的RSS^-/RS(S)_nS^-總量。最后，在第三個等分試樣中，蛋白質沉淀前處理上清液與TCEP和IAM，然后分析CAM-S-CAM-TPP，定量存在的總LMWSS^-/LMWS(S)_nS^-。

H₂S水平在4-30 pmol/mg范圍內，而過硫化物和多硫化物末端硫原子水平在2-9 pmol/mg組織范圍內。從總RSS^-/RS(S)_nS^-中減去每個樣品中的LMWSS^-/LMWS(S)_nS^-得到PrSS^-/PrS(S)_nS^-。

由于組織內主要的LMWSH是GSH，LMWSS^-與檢測為GSS-CAM-TPP的GSS^-水平比較應提供信息。評估H₂S水平的提取物的初步評估未可靠定量任何GSS-CAM-TPP。這可能部分是由于GSS-CAM-TPP的檢測限比源自H₂S的CAM-S-CAM-TPP高50倍，以及組織背景的基質效應。為了克服這些問題，研究人員對小鼠肝臟樣本應用了標準添加法(SAM)，其中組織樣本用IAM-TPP衍生以捕獲任何GSS^-為GSS-CAM-TPP，同時摻入濃度范圍的GSS-CAM-TPP，然后定量總GSS-CAM-TPP。所得圖的外推在x軸上給出截距，對應于未加標樣品中的GSS-CAM-TPP量。從這些實驗研究人員估計小鼠肝臟中GSS^-水平為12.8±2.8 pmol/mg濕重，比程序A確定的LMWSS^-的16±1.6 pmol/mg濕重低約20%。因此，兩種測量相互一致，表明GSS^-是體內組織中的主要LMWSS^-。

Persulfide and H₂S status during ischaemia and oxidative stress

H₂S水平與硫醇過硫化之間的關系尚不清楚。為了觀察H₂S水平升高是否影響過硫化，研究人員研究了心臟缺血，當缺乏氧氣和隨之而來的泛醌損失阻止線粒體SQOR氧化H₂S時，被認為導致H₂S積累。

研究人員首先在體內研究小鼠心臟，其中心臟在死亡后立即冷凍夾以評估常氧體內H₂S和過硫化物水平。為了模擬缺血，一些心臟被移除然后在離體37°C下在缺血條件下孵育30分鐘，已知這復制體內缺血期間發生的代謝變化。常氧或缺血期間速凍組織然后用IAM-TPP處理能夠定量S(CAM-TPP)₂和CAM-S-CAM-TPP。這顯示H₂S水平在缺血期間增加，但總過硫化物和多硫化物沒有。

接下來，研究人員使用離體Langendorff小鼠心臟模型將離體心臟暴露于常氧然后缺血再灌注。S(CAM-TPP)₂和CAM-S-CAM-TPP的分析再次顯示H₂S水平在缺血期間增加并在再灌注后減少。然而，總過硫化物或多硫化物沒有相應變化。這些變化不是由于Langendorff小鼠心臟模型的限制，因為研究人員通過分析使用左前降支動脈(LAD)閉塞模型的體內心臟缺血以及使用大腦中動脈閉塞(MCAO)模型的體內腦缺血獲得了可比結果。這些發現共同表明在缺血期間H₂S升高，但這本身并不導致總過硫化物增加。

預測過硫化物在氧化應激期間通過H₂S與次磺酸或二硫化物反應產生。為了評估這種可能性，研究人員將線粒體與H₂O₂在存在或缺乏H₂S的情況下孵育以產生次磺酸和二硫化物，然后評估總過硫化物和多硫化物以及GSS^-水平。由H₂O₂引起的氧化應激與H₂S結合導致過硫化物形成，檢測為CAM-S-CAM-TPP或GSS-CAM-TPP，而單獨H₂O₂或H₂S沒有。在缺乏H₂O₂和H₂S的情況下，對照線粒體含有1.9±0.2 nmol GSH/mg蛋白質，通過測量GS-CAM-TPP確定。在這些條件下，暴露于H₂O₂和H₂S導致形成76±6 pmol GSS^-/mg蛋白質，因此約4%的GSH池被過硫化，蛋白質過硫化極少。

討論與結論

對H₂S、RSS^-和RS(S)_nS^-在生物學中作用的理解一直受限于難以定量這些物種。本研究通過開發一套LC-MS/MS方法解決了這個問題，該方法能夠靈敏同步定量H₂S、RSS^-、RS(S)_nS^-和GSS^-。此外，通過適當分離蛋白質和低分子量部分，研究人員可以同時評估從分離蛋白質到線粒體再到組織勻漿的一系列生物系統中的蛋白質和低分子量RSS^-和RS(S)_nS^-。GSH過硫化物（生物學中主要的LMWSH）的平行定量為這些測量提供了進一步的正交證實。

這套新方法建立在早期發展的基礎上，這些發展捕獲反應性硫原子到診斷產物中，然后通過質譜法定量。然而，該方法相對于這些早期方法有顯著進步，原因如下：速凍樣品然后用IAM-TPP/IAM反應使研究人員能夠通過其親核反應同時捕獲和穩定所有反應性硫物種生成穩定產物，而不是留下在樣品處理過程中可能被修飾的不穩定部分；將TPP陽離子的固定正電荷納入診斷物種大大增強了LC-MS/MS檢測的靈敏度至低fmol水平；生物樣品中H₂S、RSS^-、RS(S)_nS^-和GSS^-的同時檢測是對先前方法的主要進步；以及合成一系列化學穩定標準分子及其氘代內標使得能夠通過構建考慮組織基質效應的標準曲線對生物樣品中的H₂S、RSS^-、RS(S)_nS^-和GSS^-進行絕對定量。這套方法現在可以應用于評估過硫化物和多硫化物形成在廣泛生物情境中的作用。

研究人員使用該方法定量了一系列小鼠和大鼠組織中H₂S以及過硫化物和多硫化物上的總、蛋白質和低分子量末端硫原子水平。他們發現H₂S水平在4-30 pmol/mg范圍內，而過硫化物和多硫化物末端硫原子水平在2-9 pmol/mg組織范圍內。組織內的主要LMWSS^-是GSS^-，與GSH水平遠高于其他低分子量硫醇一致。假設組織水重約70%，這些值對應于H₂S的組織濃度為6-40μM，而過硫化物和多硫化物末端硫原子的相應水平為3-13μM，所有這些都在先前報告的范圍內。

為了改變生理H₂S水平，研究人員將心臟組織暴露于缺血，預計由于還原的CoQ池通過SQOR抑制其降解而增加H₂S水平。這種預期的H₂S增加通過將其捕獲為診斷產物S(CAM-TPP)₂得到證實。然而，升高的H₂S與蛋白質或低分子量過硫化物整體水平的變化無關。這表明在這些條件下單獨升高H₂S不足以增加過硫化物水平。由于預測H₂S與二硫化物和次磺酸反應形成過硫化物，研究人員探索了將線粒體同時暴露于H₂O₂和H₂S的影響。這導致LMWS(S)_nS^-形成，其中GSS^-主導這種形成。這表明過硫化物可以在氧化應激存在H₂S的情況下形成，這可能有助于減少蛋白質和低分子量硫醇的不可逆氧化。此外，由于過硫化物具有低pK_a(~4.3)，它們在體內大部分以硫醇形式存在，并且由于非末端S原子的α效應，是比硫醇更好的親核試劑。因此，過硫化物是比單獨硫醇更有效的抗氧化劑。總之，在病理生理條件下或藥理學干預后升高的H₂S的有益效應可能主要歸因于過硫化物生成的抗氧化后果。

本研究開發的定量方法側重于H₂S水平和硫醇過硫化狀態的整體變化。可逆蛋白質過硫化的調節作用因此超出本研究范圍。然而，研究結果確實表明需要仔細考慮受過硫化調節的蛋白質摻入硫原子的機制。此外，需要定量推定的調節硫醇被過硫化的程度，因為低化學計量修飾只有在修飾激活修飾蛋白質的功能獲得時才能是調節性的。也最易受過硫化影響的硫醇也可能被一系列其他過程可逆修飾，包括谷胱甘肽化、S-亞硝基化和S-酰化，而這些修飾是否是調節性的需要在每種情況下證明。需要考慮的一種可能性是這些蛋白質硫醇修飾的大部分可能是對細胞環境變化的響應，而不是調節節點。

總之，探索H₂S和過硫化物/多硫化物形成在生物系統中的病理生理學和藥理學作用一直受缺乏量化整體變化的方法的阻礙。本研究開發了一套穩健靈敏的方法，能夠在從分離蛋白質到組織勻漿的一系列生物樣品中靈敏同步定量H₂S、PrS(S)_nS^-和LMWS(S)_nS^-。研究人員使用該方法顯示組織內PrSS^-和LMWSS^-的穩態水平較低，并且GSS^-是主要的LMWSS^-。最后，研究人員證明在缺血期間，由于SQOR失活，H₂S水平上升，但這種H₂S升高并不增加過硫化物。相反，暴露于H₂O₂與H₂S結合導致廣泛的過硫化物形成，與過硫化物在抗氧化防御中的作用一致。引入的這些方法將促進在廣泛生物情境中探索H₂S的病理生理學和藥理學作用的進展。

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