人類P2X4受體變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)：蒽醌類化合物的“離子鎖”機(jī)制與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)
《Nature Communications》：Discovery of an allosteric binding site for anthraquinones at the human P2X4 receptor
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時間：2025年12月05日
來源：Nature Communications 15.7
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本研究針對P2X4受體作為炎癥性疾病、神經(jīng)病理性疼痛和癌癥治療靶點(diǎn)但缺乏高選擇性變構(gòu)拮抗劑的難題，通過嵌合受體、突變體構(gòu)建和冷凍電鏡技術(shù)，首次解析了人類P2X4-E307T受體與蒽醌衍生物PSB-0704的復(fù)合物結(jié)構(gòu)（分辨率3.35 ?），揭示了位于三聚體亞基界面、不同于已知位點(diǎn)的新型變構(gòu)結(jié)合口袋。關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是Glu307與相鄰亞基的Arg82/Lys298形成“離子鎖”，阻礙高親和力結(jié)合；E307T突變破壞該鎖后，拮抗劑效力提升高達(dá)2500倍，為基于結(jié)構(gòu)的P2X4受體藥物設(shè)計提供了新范式。
在細(xì)胞間的通訊網(wǎng)絡(luò)中，三磷酸腺苷（ATP）不僅是能量的載體，更是重要的信號分子。當(dāng)細(xì)胞受損或處于應(yīng)激狀態(tài)時，釋放到細(xì)胞外的ATP會像一把鑰匙，激活細(xì)胞膜上名為P2X受體的離子通道大門。其中，P2X4受體亞型尤為引人關(guān)注，因?yàn)樗谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞，以及外周免疫細(xì)胞上廣泛表達(dá)，是治療神經(jīng)病理性疼痛、癲癇、炎癥乃至多種癌癥的潛力靶點(diǎn)。然而，開發(fā)靶向P2X4受體的高效、選擇性藥物卻步履維艱。一個核心挑戰(zhàn)在于，ATP結(jié)合位點(diǎn)（即正構(gòu)位點(diǎn)）在不同P2X受體亞型間高度保守，使得設(shè)計只針對P2X4而不影響其他亞型的藥物異常困難。因此，科學(xué)家們將目光投向了受體上的其他區(qū)域——變構(gòu)位點(diǎn)，希望能找到調(diào)控受體功能的新開關(guān)。
盡管已有少數(shù)P2X4受體拮抗劑被報道，如BX430、BAY-1797和5-BDBD，但它們的效力或選擇性往往不盡如人意。水溶性的蒽醌衍生物Cibacron Blue曾被描述為P2X4受體的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，但其具體作用位點(diǎn)和機(jī)制一直是個謎團(tuán)，限制了基于此類結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理藥物設(shè)計的可能。為了解決這一難題，由Christa E. Müller和Gregor Hagelueken共同領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》上發(fā)表了他們的最新研究成果，他們綜合利用計算模擬、分子生物學(xué)、藥理學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等多種技術(shù)，成功揭示了蒽醌類化合物在人類P2X4受體上的變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)，并闡明了其獨(dú)特的作用機(jī)制。
為開展此項(xiàng)研究，研究人員主要運(yùn)用了以下幾項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)：通過構(gòu)建人P2X4/P2X2嵌合受體并結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行藥理學(xué)表征，以定位關(guān)鍵功能域；利用AlphaFold 3進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測和分子對接模擬；采用熒光鈣流檢測法和雙電極電壓鉗（TEVC）技術(shù)評估化合物對受體功能的調(diào)控作用；通過放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證受體與配體的親和力；最終，利用單顆粒冷凍電鏡（cryo-EM）解析了人P2X4-E307T受體突變體與拮抗劑PSB-0704復(fù)合物的高分辨率三維結(jié)構(gòu)。
受體嵌合體、對接和突變研究揭示關(guān)鍵位點(diǎn)
研究人員首先以Cibacron Blue為先導(dǎo)化合物，發(fā)現(xiàn)在人野生型（wt）P2X4受體上，它表現(xiàn)出獨(dú)特的雙相調(diào)節(jié)作用：低濃度時增強(qiáng)ATP效應(yīng)，高濃度時則抑制。而在人P2X2受體上，它僅表現(xiàn)為抑制。為了精確定位其結(jié)合位點(diǎn)，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一系列P2X4/P2X2嵌合受體，即將P2X4受體中與P2X2差異較大的十個可變區(qū)（v1-v10）逐一替換為P2X2的對應(yīng)序列。藥理學(xué)篩選帶來了意想不到的發(fā)現(xiàn)：當(dāng)替換掉包含第301至308位氨基酸的可變區(qū)v10（嵌合體c10R301-Q308）時，Cibacron Blue的抑制效力驚人地提高了約2500倍，其半抑制濃度（IC50）從12.1 μM降至4.76 nM。
這一線索將研究焦點(diǎn)引向了v10區(qū)域。AlphaFold 3模型預(yù)測，P2X4受體中的Glu307（E307）會與相鄰亞基的Arg82（R82）和Lys298（K298）形成強(qiáng)烈的靜電相互作用，構(gòu)成一個分子內(nèi)和分子間的“離子鎖”。這個鎖的存在，可能空間上阻礙了蒽醌類化合物與受體的高親和力結(jié)合。在嵌合體c10R301-Q308中，P2X4的Glu307被P2X2中對應(yīng)的蘇氨酸（Thr）所取代，從而解開了這個“離子鎖”。隨后的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)完美驗(yàn)證了這一假說：將P2X4受體的Glu307突變?yōu)樘K氨酸（E307T）后，Cibacron Blue的抑制效力提升了680倍。而該位置的其他突變（D302I）或鄰近位點(diǎn)突變（Q308T）則影響微弱或沒有影響。這表明Glu307是影響蒽醌類化合物親和力的最關(guān)鍵殘基。
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步測試了一系列蒽醌衍生物在野生型P2X4受體、P2X4-E307T突變體和嵌合體c10R301-Q308上的活性。構(gòu)效關(guān)系（SAR）研究表明，至少需要一個酸性基團(tuán)（如磺酸基或羧基）才能產(chǎn)生拮抗活性。對于大多數(shù)化合物，在E307T突變體上的效力均顯著高于野生型受體。值得注意的是，在野生型受體上，僅含一個酸性基團(tuán)的較小分子（如PSB-0826, PSB-25012）反而比含有兩個酸性基團(tuán)的較大分子（如Cibacron Blue, PSB-0704）更具效力，這恰好支持了“離子鎖”假說：在野生型受體中，雙酸性基團(tuán)的分子更容易受到Glu307所維持的局部靜電環(huán)境的排斥。
P2X4-E307T受體蛋白的表達(dá)、純化與結(jié)構(gòu)解析
為了在原子水平上看清蒽醌類化合物的結(jié)合模式，研究團(tuán)隊(duì)選擇了活性優(yōu)良、水溶性好的衍生物PSB-0704作為研究對象，并成功表達(dá)、純化了用于結(jié)構(gòu)研究的人P2X4受體蛋白。該蛋白構(gòu)建體包含三個點(diǎn)突變：去糖基化突變（N75R, N184R）以改善蛋白均一性，以及關(guān)鍵的點(diǎn)突變E307T以增強(qiáng)配體結(jié)合。受體在昆蟲細(xì)胞（Sf9）中表達(dá)，通過去垢劑 solubilization、金屬螯合親和色譜（IMAC）純化，并重組到兩親性聚合物Amphipol A8-35中，最終用于冷凍電鏡分析。放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)，純化后重組到納米盤（nanodiscs）中的P2X4-E307T受體仍保持高親和力結(jié)合ATP類似物[35S]ATPγS的能力，表明其生物活性構(gòu)象得以保留。
P2X4受體與PSB-0704復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)
研究人員最終獲得了分辨率為3.35 ?的人P2X4-E307T受體與PSB-0704復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)清晰地展示了P2X受體典型的三聚體“海豚”形態(tài)，包括巨大的胞外域和兩個跨膜（TM）螺旋。
最關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)是，在三個亞基的界面處，位于頭部結(jié)構(gòu)域后方，存在一個明確的電子密度，對應(yīng)于結(jié)合的PSB-0704分子。這表明了一個全新的變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)，其位置不同于先前在斑馬魚或人P2X4受體上發(fā)現(xiàn)的BX430/BAY-1797結(jié)合位點(diǎn)。
結(jié)構(gòu)分析揭示了詳細(xì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)：PSB-0704的蒽醌母核通過疏水作用和陽離子-π堆積與受體結(jié)合。其環(huán)C和環(huán)D上的兩個羧基分別與來自相鄰亞基的兩個精氨酸殘基形成關(guān)鍵的鹽橋：環(huán)C的羧基與Arg301（R301）形成雙齒鹽橋，而環(huán)D的羧基則與Arg82（R82）相互作用，此外，Arg82的胍基還與PSB-0704的環(huán)B和環(huán)C形成陽離子-π堆積。這種結(jié)合模式巧妙地解釋了為何E307T突變會大幅提升親和力：在野生型受體中，Glu307會與Arg82和Lys298形成“離子鎖”，占據(jù)了部分結(jié)合空間，并改變了局部靜電環(huán)境，從而不利于帶負(fù)電的蒽醌衍生物高親和力結(jié)合。
雙電極電壓鉗實(shí)驗(yàn)和基于結(jié)構(gòu)的突變研究
為了驗(yàn)證冷凍電鏡結(jié)構(gòu)所揭示的相互作用，研究團(tuán)隊(duì)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)了野生型和一系列P2X4受體點(diǎn)突變體，并利用雙電極電壓鉗（TEVC）技術(shù)測試了PSB-0704及其更有效的類似物PSB-0739（磺酸基取代羧基）的抑制效果。結(jié)果表明，在E307T突變體上，兩種化合物均能有效抑制ATP（10 μM）誘導(dǎo)的電流。當(dāng)在E307T突變體基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將結(jié)合口袋中的關(guān)鍵堿性殘基突變?yōu)楸彼釙r（如R82A, R301A, K298A），拮抗劑的效力顯著降低，尤其是R82A突變的影響最為顯著，這直接證實(shí)了Arg82在配體結(jié)合中的核心作用。而將Arg301突變?yōu)橥瑯訋д姷馁嚢彼幔≧301K），則對拮抗劑效力影響不大，說明此處的正電荷是相互作用的關(guān)鍵。其他殘基的突變（如N110A, F81A, I312F）則影響較小或沒有影響，與結(jié)構(gòu)觀察一致。
本研究通過多學(xué)科交叉的方法，成功地在人類P2X4受體上發(fā)現(xiàn)并表征了一個全新的變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)適用于蒽醌類衍生物。研究的核心機(jī)制在于揭示了Glu307介導(dǎo)的“離子鎖”如何調(diào)控此類化合物的結(jié)合親和力。解開的E307T突變體與PSB-0704的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，首次在原子分辨率上展示了該結(jié)合位點(diǎn)的精確位置和配體-受體相互作用細(xì)節(jié)，該位點(diǎn)位于三聚體亞基界面，與已知的其他P2X受體變構(gòu)位點(diǎn)均不相同。
- 1.推動了P2X受體基礎(chǔ)生物學(xué)認(rèn)知：不僅揭示了P2X4受體的一種新的變構(gòu)調(diào)控機(jī)制，還豐富了我們對P2X受體家族結(jié)構(gòu)和功能多樣性的理解。
- 2.為理性藥物設(shè)計提供了堅實(shí)基礎(chǔ)：高分辨率結(jié)構(gòu)為基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計（SBDD）提供了精準(zhǔn)的模板，可用于指導(dǎo)開發(fā)更高效力、更高選擇性的P2X4受體拮抗劑。例如，可根據(jù)結(jié)構(gòu)信息優(yōu)化蒽醌母核，減少潛在的毒性（如去除醌結(jié)構(gòu)），或引入可與“離子鎖”殘基相互作用的新基團(tuán)，以克服野生型受體中的結(jié)合障礙。
- 3.揭示了相鄰位點(diǎn)間的潛在聯(lián)系：研究發(fā)現(xiàn)，已知的拮抗劑BX430和BAY-1797在E307T突變體上的效力也有所提升，暗示其結(jié)合位點(diǎn)與蒽醌位點(diǎn)相鄰且可能存在變構(gòu)耦合，這為設(shè)計同時結(jié)合兩個位點(diǎn)的“雙位點(diǎn)”或“雙配體”藥物提供了新思路。
- 4.提供了化學(xué)生物學(xué)研究新工具：高親和力的P2X4-E307T/Cibacron Blue配對，未來或可通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建表達(dá)該突變受體的細(xì)胞或動物模型，實(shí)現(xiàn)對其功能的特異性化學(xué)干預(yù)，從而在復(fù)雜的生理病理過程中精確解析P2X4受體的功能。
總之，這項(xiàng)研究突破了P2X4受體靶向藥物開發(fā)的瓶頸，為治療神經(jīng)炎癥、慢性疼痛和癌癥等重大疾病提供了新的靶點(diǎn)和策略，標(biāo)志著P2X受體研究領(lǐng)域的一個重要進(jìn)展。
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