Tpt1催化核酸磷酸轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵中間體與產(chǎn)物晶體結(jié)構(gòu)解析

《Nature Communications》：Crystal structures and snapshots along Tpt1-catalyzed phosphate transfer from nucleic acid to NAD+

【字體： 大 中 小 】 時間：2025年12月05日 來源：Nature Communications 15.7

　　

在生命的基本運作中，轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）扮演著不可或缺的角色，它將遺傳密碼轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)。然而，許多tRNA的成熟需要經(jīng)歷一個精細(xì)的剪接過程，即移除其前體中的內(nèi)含子。在真菌和植物中，這個過程最終且關(guān)鍵的一步是由Tpt1酶完成的：它負(fù)責(zé)移除剪接連接處的2'-磷酸基團(tuán)（2'-PO₄^2-）。如果這一步失敗，tRNA就無法正常行使其功能，可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。有趣的是，Tpt1及其在細(xì)菌和哺乳動物中的同源蛋白（分別稱為KptA和TRPT1）雖然存在于幾乎所有生命領(lǐng)域，但它們的功能似乎不止于tRNA剪接。例如，在哺乳動物和細(xì)菌中，這些蛋白可以催化核酸5'末端的ADP-核糖化，這是一種可逆的化學(xué)修飾。盡管經(jīng)過多年的生物化學(xué)研究，科學(xué)家們已經(jīng)提出了Tpt1催化的兩步反應(yīng)機(jī)制，但一直缺乏直接的結(jié)構(gòu)證據(jù)來捕捉反應(yīng)過程中的關(guān)鍵中間體和最終產(chǎn)物。這限制了我們對其催化機(jī)理的深入理解，也阻礙了以其為靶點的藥物開發(fā)（例如針對致病真菌）。為了解決這一難題，研究人員將目光投向了來自超嗜熱古菌Thermococcus kodakarensis的Tpt1（TkoTpt1）。

本研究綜合運用了蛋白質(zhì)晶體學(xué)、體外酶活測定和質(zhì)譜分析等多種技術(shù)手段。研究人員首先克隆、表達(dá)并純化了TkoTpt1野生型及其一系列點突變體蛋白。通過體外催化實驗，驗證了TkoTpt1不僅能夠催化RNA 2'-PO₄^2-的轉(zhuǎn)移，還展現(xiàn)出對DNA/RNA 5'-PO₄^2-的轉(zhuǎn)移活性，并利用動力學(xué)分析測定了反應(yīng)的表觀速率常數(shù)。研究的關(guān)鍵在于利用X射線晶體學(xué)技術(shù)，成功解析了TkoTpt1在不同反應(yīng)狀態(tài)下的共計11個高分辨率晶體結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)包括TkoTpt1與底物類似物（如2',3',5'-三磷酸核苷）、輔因子NAD⁺、其類似物ADPR、5'-磷酸DNA以及反應(yīng)中間體和產(chǎn)物的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。此外，還通過MALDI-TOF質(zhì)譜分析驗證了TkoTpt1與ADPR之間可形成共價加合物。

TkoTpt1具有核酸5'-PO₄^2-催化活性

通過體外實驗證實，TkoTpt1能夠以含有5'-PO₄^2-的DNA為底物，在NAD⁺存在下，于80°C的高溫下催化反應(yīng)，生成兩種產(chǎn)物。時間進(jìn)程分析表明，先產(chǎn)生一個遷移較慢的中間體，隨后轉(zhuǎn)化為遷移較快的最終產(chǎn)物5'-OH DNA。DNA 5'末端核苷酸的身份影響兩步反應(yīng)的速率常數(shù)。TkoTpt1同樣可以催化5'-磷酸RNA的類似反應(yīng)，但速率較慢。

TkoTpt1的整體構(gòu)象是靈活的

解析的未結(jié)合TkoTpt1結(jié)構(gòu)顯示，該蛋白由N端葉（N-lobe）和C端葉（NAD⁺-lobe）組成，兩個結(jié)構(gòu)域之間的相對取向非常靈活，可以采取多種構(gòu)象，提示其具有構(gòu)象可塑性。

TkoTpt1與NAD⁺和底物DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

解析的TkoTpt1/DNA/NAD⁺三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)揭示了NAD⁺和內(nèi)部DNA核苷酸與TkoTpt1的結(jié)合模式。NAD⁺與NAD⁺-lobe的多個殘基形成廣泛的氫鍵和堆積相互作用。DNA底物采取U型構(gòu)象，其核堿基被翻轉(zhuǎn)出來。結(jié)構(gòu)分析表明，結(jié)晶條件中高濃度的SO₄^2-可能模擬2'-PO₄^2-，占據(jù)了催化位點，從而抑制了反應(yīng)的發(fā)生。與未結(jié)合結(jié)構(gòu)相比，復(fù)合物結(jié)構(gòu)中N-lobe相對于NAD⁺-lobe發(fā)生了近90度的旋轉(zhuǎn)，表明底物和抑制劑的結(jié)合誘導(dǎo)了大的構(gòu)象變化。

TkoTpt1可以催化形成Appr>P產(chǎn)物

在去除高濃度硫酸銨的結(jié)晶條件下，獲得了兩個捕獲了最終產(chǎn)物Appr>P的TkoTpt1/DNA/Appr>P復(fù)合物結(jié)構(gòu)（復(fù)合物A和B）。結(jié)構(gòu)顯示，NAD⁺已被轉(zhuǎn)化為Appr>P，其環(huán)狀磷酸基團(tuán)與TkoTpt1的Arg17和Arg65形成氫鍵。復(fù)合物中的DNA并非反應(yīng)最初的5'末端核苷酸，而是內(nèi)部核苷酸，表明反應(yīng)完成后產(chǎn)物5'-OH DNA被釋放，并在結(jié)晶過程中重新結(jié)合。

5'-p-ADPR-DNA是TkoTpt1催化反應(yīng)的關(guān)鍵中間體

通過點突變和體外活性驗證，發(fā)現(xiàn)Lys63的突變（K63A）能夠使反應(yīng)停留在中間體步驟。解析的K63A/5'-p-ADPR-DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)清晰地捕獲了關(guān)鍵中間體5'-p-ADPR-DNA，其中DNA的5'-PO₄^2-與ADP-核糖的1"位共價連接，而煙酰胺已被釋放。該中間體的磷酸連接區(qū)與Arg17和Arg65形成氫鍵。與產(chǎn)物復(fù)合物結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，中間體中ADP-核糖連接的腺苷構(gòu)象以及磷酸基團(tuán)取向與產(chǎn)物狀態(tài)有顯著不同，且其中O2"-P-O5'角度不利于第二步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的發(fā)生，說明Lys63可能參與催化所需的構(gòu)象重排。

捕獲反應(yīng)前的狀態(tài)

使用ADPR（ADP-核糖）作為NAD⁺的類似物進(jìn)行結(jié)晶，獲得了TkoTpt1/DNA/ADPR復(fù)合物結(jié)構(gòu)。出乎意料的是，結(jié)構(gòu)顯示TkoTpt1的Lys63側(cè)鏈與ADPR的核糖形成了共價連接。同時，DNA的5'-PO₄^2-清晰可見于催化位點，并被Arg17、Arg65和Tyr77穩(wěn)定。該結(jié)構(gòu)成功捕獲了反應(yīng)前底物準(zhǔn)備就緒的狀態(tài)。質(zhì)譜分析證實了TkoTpt1與ADPR之間可形成共價加合物，但反應(yīng)速度很慢。

RNA 2'-PO₄^2-被TkoTpt1的N端葉識別

為了解TkoTpt1如何識別RNA 2'-PO₄^2-，研究人員解析了TkoTpt1與2',3',5'-三磷酸腺苷（2',3',5'-p-A）和2',3',5'-三磷酸尿苷（2',3',5'-p-U）的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)表明，2'-PO₄^2-主要與N-lobe的殘基（如Arg17, Lys63, Arg65）相互作用，而5'-PO₄^2-和3'-PO₄^2-則形成較弱的相互作用或與NAD⁺-lobe相互作用，突出了N-lobe在識別2'-磷酸中的主要作用。

TkoTpt1能夠催化RNA 2'-PO₄^2-與NAD⁺的反應(yīng)

進(jìn)一步解析的K63A/2'-p-ADPR-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)成功捕獲了RNA 2'-PO₄^2-轉(zhuǎn)移反應(yīng)的關(guān)鍵中間體2'-p-ADPR-RNA。該中間體的2'-PO₄^2-與NAD⁺的煙酰胺置換位點共價連接。結(jié)構(gòu)分析顯示，與DNA 5'-PO₄^2-轉(zhuǎn)移相比，RNA 2'-PO₄^2-轉(zhuǎn)移形成中間體時所需的核苷構(gòu)象旋轉(zhuǎn)較小，但中間體的O2"-P-O2'角度仍需要進(jìn)一步的構(gòu)象調(diào)整才能進(jìn)行第二步反應(yīng)。

本研究通過解析TkoTpt1在反應(yīng)不同階段的系列晶體結(jié)構(gòu)，首次直接可視化了Tpt1/TRPT1/KptA家族酶催化磷酸轉(zhuǎn)移的全過程，包括反應(yīng)前的底物結(jié)合狀態(tài)、關(guān)鍵的5'-p-ADPR-DNA和2'-p-ADPR-RNA中間體、以及最終的Appr>P產(chǎn)物。這些結(jié)構(gòu)證據(jù)有力地證實了該家族酶保守的兩步催化機(jī)制。研究揭示TkoTpt1利用相似的機(jī)制轉(zhuǎn)移核酸的5'-PO₄^2-或2'-PO₄^2-，并強調(diào)了蛋白構(gòu)象靈活性在催化中的重要性。一個保守的Arg-His-Arg-Arg四聯(lián)體被證實對催化至關(guān)重要，而Lys63在TkoTpt1中可能參與促進(jìn)第二步反應(yīng)所需的構(gòu)象重排。這些發(fā)現(xiàn)深化了對tRNA剪接最終步驟分子機(jī)制的理解，也為闡明核酸ADP-核糖化這一新興的RNA/DNA修飾提供了結(jié)構(gòu)框架。鑒于Tpt1在多種人類致病真菌中的必需性，本研究獲得的高分辨率結(jié)構(gòu)信息，特別是與底物或中間體結(jié)合的狀態(tài)，為針對該靶點設(shè)計特異性抗真菌藥物提供了寶貴的見解。雖然ADPR與酶形成的共價加合物反應(yīng)緩慢，并非理想的先導(dǎo)化合物，但這些結(jié)構(gòu)揭示了酶活性位點的精確幾何特征和關(guān)鍵相互作用，將有力地推動基于結(jié)構(gòu)的抑制劑設(shè)計。