人T細胞白血病病毒衣殼蛋白：一個未被發掘的潛在藥物靶點的高分辨率結構解析

《Nature Communications》：The Human T-cell Leukemia Virus capsid protein is a potential drug target

【字體： 大 中 小 】 時間：2025年12月05日 來源：Nature Communications 15.7

　　

人T細胞白血病病毒1型（HTLV-1）自1979年被發現以來，一直是人類健康的重要威脅。作為首個被確認可導致人類疾病的反轉錄病毒，HTLV-1感染約10%的攜帶者會發展為侵襲性致死性惡性腫瘤——成人T細胞白血病（ATL），和/或進行性神經系統炎癥性疾病——HTLV-1相關脊髓病/熱帶痙攣性截癱（HAM/TSP）。后者臨床表現為肌肉僵硬、無力、腸道和膀胱功能障礙以及性功能障礙等致殘性癥狀。此外，攜帶者還可能出現其他相關炎癥性疾病，包括肺部疾病、支氣管擴張、葡萄膜炎和皮炎等。HTLV-1遍布全球，在每個有人居住的大陸都有流行區，已被分為7個亞型（A至G）。其中，亞型A（又稱世界性毒株）遍布全球，尤其在日本流行，估計已感染110萬人；亞型B、D、E、F和G主要局限于非洲；而亞型C（又稱澳大利亞/美拉尼西亞亞型）發現于斐濟/所羅門群島、巴布亞新幾內亞和澳大利亞中部的原住民社區。事實上，這些社區擁有世界上最高的HTLV-1感染率，近期研究表明高達40%的成年人口病毒檢測呈陽性。

與HTLV-1形成鮮明對比的是，另一種能導致人類疾病的反轉錄病毒——人類免疫缺陷病毒（HIV），在過去的幾十年里，其治療取得了巨大成功。針對HIV/AIDS的成功治療積累了豐富的抗病毒藥物。相比之下，目前對HTLV-1尚無有效的抗病毒治療方法，出現癥狀的患者預后仍然很差。某些最初為治療HIV/AIDS而開發的抗病毒藥物（如核苷類逆轉錄酶抑制劑替諾福韋和整合酶鏈轉移抑制劑多替拉韋）可以在體外阻止HTLV-1的傳播，表明臨床研究應考慮其作為暴露前預防（PrEP）的有效性。蛋白酶抑制劑顯示出一定的活性，但通常效力較低，且作用于病毒生命周期的晚期階段。盡管尚未進行臨床研究，但這些研究凸顯了HTLV-1治療的潛力以及當前可用抗病毒藥物庫的有限性。即使成功，若無額外的抗病毒靶點，聯合療法的范圍將受限，從而增加病毒逃逸的真實可能性。

近年來，對抗HIV感染的最新策略是“衣殼抑制”。對HIV衣殼的研究表明，衣殼并非惰性“外殼”，而是協調病毒感染的許多早期階段。在病毒生命周期的進入后早期階段，衣殼保護病毒遺傳物質免受核酸酶（如TREX）和先天傳感器（如cGAS）的侵害；它結合馬達蛋白以在細胞質中導航；它作為半透性反應室促進逆轉錄過程；它介導核進入；并在核內分區進入膜性無區室，指導病毒DNA整合到常染色質的特定區域。值得注意的是，衣殼由單一蛋白質CA構成，組裝成一個包含約250個CA六聚體和恰好12個CA五聚體的富勒烯錐體。組裝衣殼的穩定性經過精細調節，因為它必須在核內適當的時間和地點“脫殼”以釋放病毒DNA。衣殼的多功能性和亞穩定性意味著CA突變通常會給病毒帶來顯著的適應性代價。這種“遺傳脆弱性”以及衣殼帶有宿主結合口袋的事實，使得HIV衣殼在近年來成為一個有吸引力的藥物靶點。

Lenacapavir是首個獲批的同類抗衣殼藥物，于2022年獲得歐盟（EU）和美國食品藥品監督管理局（FDA）批準，用于經治經驗豐富、具有多重耐藥性HIV感染的成人。由于其從注射部位釋放緩慢和清除時間長，lenacapavir僅需每半年給藥一次。因此，它正被考慮用于暴露前預防，并且是首個在3期HIV預防試驗中顯示零感染的抗病毒藥物。Lenacapavir是基于HIV CA蛋白的X射線晶體結構設計的。它主要結合在HIV CA N端結構域（CA_NTD）表面由螺旋3、4和5之間形成的疏水口袋。與鄰近CA單體C端結構域（CA_CTD）上的螺旋8和9的額外接觸確保藥物優先結合組裝的衣殼晶格。HIV利用該位點與多種宿主蛋白結合，包括Sec24C、CPSF6和核孔復合物的苯丙氨酸-甘氨酸（FG）重復結構域。通過結合該位點，lenacapavir不僅抑制宿主輔助因子結合，還促進異常衣殼組裝并破壞成熟衣殼完整性。這些多重作用機制解釋了lenacapavir的高效力（EC₅₀= 23 pM），并凸顯了靶向反轉錄病毒衣殼的治療價值。

盡管HTLV-1衣殼在亞型間幾乎相同，存在超過50,000年的分化，但其高度保守性表明HTLV-1衣殼可能同樣具有遺傳脆弱性，高度優化以適應人類宿主，也可能代表開發長效預防劑的可行靶點。作為一種無酶活性的結構蛋白，有必要了解HTLV-1 CA蛋白的結構、其晶格形成和相互作用，以加速該領域的藥物開發。

本研究聚焦于解析成熟長度HTLV-1c CA蛋白的高分辨率晶體結構。研究人員克服了先前研究中報道的HTLV-1a CA蛋白表達和純化困難，發現HTLV-1c CA及其組成結構域易于表達，是高度穩定的蛋白質，其晶體分辨率常規超過已得到更廣泛研究的HIV CA。研究成功解析了HTLV-1c CA_NTD的原子分辨率結構，揭示了其與HIV-1 CA_NTD的結構差異，如缺乏螺旋6、更短的環區結構以及固定的N端β-發夾“開放”構象。

NTD 與 HIV-1 CA_NTD的結構比較。a HTLV-1 CA_NTD1-127的二級結構元素標記。b HTLV-1 CA_NTD與 HIV-1 CA_NTD（PDB 4XFX）疊加比較。'>

研究人員還獲得了HTLV-1 CA_NTD的六方晶型，揭示了衣殼晶格堆積的特征，包括由六個K18殘基在六聚體中心形成的帶正電的“孔”。

NTD 六方晶格的特征及相互作用界面。a, b 六方晶型中HTLV-1 CA_NTD形成六聚體并擴展為六方晶格。e HTLV-1 CA_NTD六聚體中心由K18形成帶正電的孔（直徑20.2 ?）。'>

全長成熟HTLV-1 CA蛋白結晶為六方晶格。結構分析表明，其晶格堆積更接近于未成熟衣殼晶格，與α-和β-反轉錄病毒晶格相似，而與HIV（慢病毒）的成熟晶格不同。CTD形成不對稱的同源二聚體，由螺旋9介導。

通過與其他反轉錄病毒（如RSV、MLV）的冷凍電子斷層掃描子斷層圖平均結構比較，進一步確認了HTLV-1c CA晶體堆積與未成熟晶格的一致性。

在晶體篩選中，研究人員在HTLV-1 CA_NTD的正交晶型中發現了一個硫酸根（SO₄^2-）結合口袋。該口袋由螺旋3、4、5和7形成，由殘基H71、H72、R98和W117協調。該位點在結構上等同于HIV-1 CA_NTD中結合宿主因子（如CPSF6、FG-nucleoporins）和藥物lenacapavir的位點。

NTD正交晶型中發現的SO₄結合口袋。a-c 無配體（apo）和SO₄結合的CA_NTD結構疊加顯示結合位點。d 該位點結構上等同于HIV-1 CA_NTD中的FG結合位點。e-g HIV-1 CA中該位點被lenacapavir、NUP153或CPSF6占據。'>

為驗證該口袋的功能重要性，研究人員構建了21個HTLV-1c CA表面殘基點突變體，并在復制依賴的感染系統中測試其感染性和病毒粒子產生。突變靶點包括六聚體內界面、NTD三聚體界面、CTD二聚體三聚體界面以及硫酸鹽/磷酸鹽結合口袋。結果顯示，結合口袋關鍵殘基（H71A, H72A, R98A, W117A）的突變完全廢除了病毒感染性，并伴隨病毒粒子產生的減少，表明該位點對衣殼功能至關重要。此外，還發現了一個能提高感染性的突變體H190A。

關鍵實驗技術方法

本研究主要運用了分子克隆技術構建HTLV-1c CA及其結構域（全長、NTD、CTD）的重組表達載體；在大腸桿菌Rosetta 2(DE3) pLysS中過量表達重組蛋白；通過硫酸銨沉淀、離子交換色譜和尺寸排阻色譜純化蛋白；采用坐滴法和懸滴法蒸汽擴散法進行蛋白質結晶篩選和優化；利用同步輻射X射線衍射（澳大利亞同步輻射中心MX2光束線）收集晶體衍射數據；使用分子置換法（以AlphaFold2預測模型或已解析結構作為搜索模型）解析晶體結構，并通過Phenix和Coot進行結構修正和優化；采用納米差示掃描熒光法（nanoDSF）分析蛋白熱穩定性；利用基于熒光報告基因的復制依賴型HTLV-1細胞間感染系統（使用HEK-293T細胞）進行點突變體的感染性表型分析；通過流式細胞術檢測GFP陽性細胞以評估感染性，并使用p19 ELISA檢測病毒粒子產量。

研究結果

Atomic resolution of HTLV-1 CA_NTD

研究人員成功解析了HTLV-1c CA_NTD（殘基P1-S127）的原子分辨率（0.87 ?）晶體結構。結構顯示了一個N端β-發夾（殘基1-13），隨后是6個α-螺旋和一個位于螺旋4和5之間的附加3₁₀螺旋。與HIV-1 CA_NTD的結構比對揭示了三個主要差異：HTLV-1 CA缺乏HIV中的螺旋6；具有更短、更緊湊的4-5環（相當于HIV的親環蛋白結合環），且不含構象動態的異構肽鍵；HTLV-1 CA的N端β-發夾固定于“開放”構象，不像HIV-1 M群病毒那樣具有pH依賴性構象切換能力。

Hexagonal crystal form of HTLV-1 CA_NTDreveals capsid lattice packing

HTLV-1 CA_NTD的六方晶型（P622）顯示了由晶體學對稱性生成的六方“片層”結構，其特征類似于其他反轉錄病毒衣殼晶格堆積。六聚體中心由六個K18殘基形成一個帶正電的孔，其直徑（20.2 ?）大于HIV-1中由R18形成的孔（16.2 ?）。

Full-length mature HTLV-1 CA crystallises as a hexagonal lattice

全長HTLV-1 CA（P1-L214）晶體結構解析至2.25 ?分辨率。盡管具有成熟的N端β-發夾和鹽橋（P1-D54），但其晶格堆積（NTD和CTD處于不同平面，晶格間距較近，74.6 ?）與已知的未成熟衣殼晶格（如HTLV-1a、RSV、MLV）更為一致，而與HIV的成熟晶格（NTD和CTD處于同一平面，間距92.0 ?）不同。CA_CTD形成由螺旋9介導的不對稱同源二聚體。比較分析強烈表明，該全長CA晶體結構代表了一種更接近于未成熟狀態的晶格堆積，可能是一種成熟中間體。

Crystallant binding pocket may indicate a druggable site

在含有硫酸銨的結晶條件下，在HTLV-1 CA_NTD表面由螺旋3、4、5和7形成的電正性口袋中明確解析出一個硫酸根離子，該口袋由H71、H72、R98和W117協調。該位點在結構上等同于HIV-1 CA中結合宿主因子（Sec24C、CPSF6、FG-nucleoporins）和lenacapavir的疏水口袋。通過晶體浸泡實驗證實，該口袋也能結合磷酸根離子。配體結合誘導了H72和R98等殘基的構象變化。

Capsid surface residues mediate infectivity and/or particle production

點突變分析表明，位于六聚體內界面、NTD三聚體界面、硫酸鹽/磷酸鹽結合口袋和CTD二聚體界面的關鍵殘基突變對病毒感染性和/或病毒粒子產生具有顯著影響。特別是，硫酸鹽/磷酸鹽結合口袋的關鍵殘基（H71A, H72A, R98A, W117A）突變完全廢除了感染性并減少了病毒粒子產生，凸顯了該位點的重要性。此外，發現了能提高感染性的突變體H190A。測試的所有突變殘基在已知HTLV-1亞型間完全保守。

結論與討論

本研究首次報道了HTLV-1c CA蛋白及其結構域的高分辨率晶體結構，分辨率超越了已得到廣泛研究的HIV CA。結構揭示了HTLV-1 CA與HIV CA在關鍵表面特征上的顯著差異，如固定的β-發夾、缺乏螺旋6和更緊湊的4-5環，表明其胞質面構象動態性遠低于HIV。全長CA晶格堆積更接近于未成熟狀態，類似于α-和β-反轉錄病毒，提示其可能代表一種成熟中間體。

最重要的發現之一是鑒定了一個在HTLV-1 CA_NTD上由螺旋3、4、5和7形成的電正性配體結合口袋，該口袋在結構上等同于HIV CA中關鍵的宿主因子結合和藥物（lenacapavir）靶向位點。盡管HTLV-1對該藥物不敏感，但該口袋能結合硫酸根/磷酸根離子，且其關鍵殘基對病毒 infectivity 和粒子產生至關重要。這強烈提示該位點是HTLV-1衣殼功能的關鍵，并且由于其高保守性，是一個有前景的、可能對所有HTLV-1亞型有效的抗病毒藥物開發靶點。

研究還發現了一些僅降低感染性而不影響粒子產生的表面突變體（如K18A），以及一個能增強感染性的罕見突變體（H190A），這些位點值得進一步研究以揭示衣殼功能的新方面。

總之，該研究為理解HTLV-1衣殼結構奠定了基礎，并有力地支持了衣殼作為HTLV-1治療和預防（尤其是開發長效暴露前預防劑）的一個脆弱且可行的藥物靶點。重組CA蛋白的穩健性和易于獲得高分辨率晶體結構的能力，為基于結構的藥物設計和篩選平臺的開發提供了可行性。對HTLV-1衣殼功能和相互作用的進一步理解，無疑將為如何最有效地干預HTLV-1傳播提供重要見解。