天天干夜夜撸,成人av天堂,国内视频自拍

可編程Argonaute介導的cfDNA單核苷酸變異測序技術實現多癌種早期檢測

《Nature Communications》：Programmable Argonaute-mediated single-nucleotide variant sequencing of cell-free DNA for multi-cancer early detection

【字體：大中小】 時間：2025年12月05日 來源：Nature Communications 15.7

編輯推薦：

　　本文報道了一種新型的酶切引導單核苷酸變異測序（EC-SNV-Seq）技術，通過整合Argonaute介導的特異性切割和莖環DNA引發的級聯PCR擴增，實現了對循環腫瘤DNA（ctDNA）中低頻突變（靈敏度達0.01% VAF）的高靈敏檢測，為多癌種早期篩查提供了簡單、經濟且高效的新方案。

癌癥是全球第二大死因，世界衛生組織數據顯示2020年約有1000萬人因癌癥死亡。早期發現是改善患者預后的關鍵，而液體活檢（liquid biopsy）作為一種非侵入性檢測手段，通過分析血液中的循環腫瘤DNA（ctDNA），為癌癥的早期檢測、治療監測和個性化治療提供了動態信息。然而，血液中ctDNA濃度極低，且混雜大量正常DNA，使得檢測變得異常困難。傳統的下一代測序（NGS）和微滴式數字PCR（ddPCR）等技術各有局限：NGS雖能全面分析突變，但需要高測序深度，成本高昂；ddPCR靈敏度高，但難以同時檢測多種突變。因此，開發一種簡單、經濟、高效的高靈敏度cfDNA突變檢測方法成為當務之急。

近日，發表在《Nature Communications》上的一項研究提出了一種名為"酶切引導單核苷酸變異測序"（Enzymatic Cleavage-directed Single Nucleotide Variant Sequencing, EC-SNV-Seq）的新技術。該技術通過將Argonaute介導的特異性切割與莖環DNA（stem-loop DNA）引發的級聯PCR（cascade-PCR）信號放大相結合，實現了對cfDNA中單核苷酸變異（single-nucleotide variant, SNV）的高靈敏度、高特異性檢測，為多癌種早期檢測提供了新工具。

本研究主要采用了以下關鍵技術方法：1）利用嗜熱Argonaute（TtAgo）蛋白/向導DNA（guide DNA）復合物對預擴增后的cfDNA進行突變等位基因特異性切割；2）開發莖環DNA和間隔寡核苷酸（spacer oligo）系統，特異性識別切割產物并啟動級聯PCR擴增；3）通過TaqMan實時熒光定量PCR進行信號讀取；4）使用臨床血漿樣本（來自癌癥患者和健康捐贈者）和細胞系cfDNA參考標準進行方法驗證；5）與ddPCR進行性能對比評估。

EC-SNV-Seq檢測技術的開發

研究人員首先開發了EC-SNV-Seq檢測技術，該技術包含三個主要步驟：cfDNA的預擴增、TtAgo介導的突變等位基因特異性切割，以及莖環DNA引發的級聯PCR信號放大。他們發現，與化膿性鏈球菌Argonaute（PfAgo）相比，TtAgo在區分單核苷酸變異方面表現更優。通過優化間隔寡核苷酸的長度和修飾（如添加四個未修飾核苷酸），有效降低了野生型DNA的背景噪音。該技術對合成核苷酸和NSCLC ctDNA參考標準的檢測靈敏度達到0.01%的變異等位基因頻率（VAF），并且在54°C至64°C的退火溫度范圍內表現穩健。

可編程的多重DNA突變檢測

研究證實EC-SNV-Seq具備多重檢測能力。他們使用包含六種合成核苷酸變異/野生型對（各1μM，1% VAF）的混合物，以及包含四種突變（0.8% EGFR^L858R、0.8% EGFR^E746_A750、0.5% KRAS^G12V和1% KRAS^G12D）的NSCLC cfDNA參考標準，成功實現了4重突變檢測和分類。在六名攜帶不同突變（PIK3CA^E545K、EGFR^L858R、EGFR^E746_A750、KRAS^G12A、KRAS^G12V和KRAS^G12D）的癌癥患者混合血漿樣本中，EC-SNV-Seq也成功進行了多重突變分析，盡管由于血漿混合導致EGFR^L858R信號稀釋而未檢測到。這表明該技術在癌癥診斷中具有精確突變分析的潛力。

EC-SNV-Seq檢測的單核苷酸變異測序

研究展示了EC-SNV-Seq區分KRAS基因第12密碼子單核苷酸錯義置換（c.35 G>T對應G12V，G>A對應G12D，G>C對應G12A）的能力。凝膠電泳證實了TtAgo/向導DNA復合物對每種錯義置換的特異性切割。使用不同VAF（0.1%至100%）的合成核苷酸樣本和含有0.1% KRAS^G12D及0.05% KRAS^G12V的稀釋cfDNA參考標準，EC-SNV-Seq對單突變核苷酸錯義置換的識別檢測限（LoD）達到0.1%。在15名癌癥患者和15名健康個體的臨床樣本測試中，EC-SNV-Seq準確預測了14名癌癥患者的突變核苷酸基因型和14份野生型樣本，與組織活檢結果高度一致，盡管在區分高度相似的KRAS^G12A和KRAS^G12V時出現個別誤分類。

基于EC-SNV-Seq分析的多癌種早期檢測

研究人員將EC-SNV-Seq應用于多癌種早期檢測，并與ddPCR方法進行比較。在35份臨床血漿樣本（20份癌癥患者，15份健康人）中，EC-SNV-Seq正確識別出20份癌癥樣本中的19份，靈敏度達95%，特異性為93.3%，總體準確率為94.29%。其受試者工作特征曲線下面積（AUC）為0.977，與ddPCR（AUC=0.975）相當。這表明EC-SNV-Seq在檢測cfDNA低頻突變方面具有成為簡單、經濟、靈敏診斷工具的潛力。

基于混合血漿樣本的人群規模多癌種早期篩查

為評估EC-SNV-Seq在人群規模篩查中的適用性，研究將60名癌癥患者和10名健康捐贈者的血漿樣本（每人50μL）分組混合。EC-SNV-Seq成功在多個參與者組中識別出特定突變，例如在第1組5號參與者中檢出PIK3CA^E545K，在第4組31號參與者及第6組51號和58號參與者中檢出KRAS^G12D等。與非癌癥組的陰性結果相比，EC-SNV-Seq在70份樣本的突變篩查中靈敏度為66.67%，特異性為100%，精確度為100%，總體準確度為95.71%，AUC為0.8645，顯示出其在資源有限環境下進行人群規模突變分析和多癌種早期篩查的潛力。

綜上所述，EC-SNV-Seq技術通過結合TtAgo的高特異性切割能力和莖環DNA引發的級聯PCR信號放大，實現了對cfDNA中低頻單核苷酸變異的高靈敏度（0.01% VAF）、高特異性檢測，且無需復雜的突變富集步驟。該技術具備單核苷酸分辨率、多重檢測能力、樣本需求量小（低至50μL血漿）、檢測速度快（約2小時）以及成本低廉（每反應約3.32美元）等優勢。其在臨床樣本驗證中表現出的高性能，以及與ddPCR相當的高診斷準確性，標志著其在非侵入性多癌種早期檢測、治療監測和個性化醫療策略制定方面具有重大應用前景。未來，該技術有望進一步擴展至mRNA、miRNA等核酸生物標志物的檢測，并整合更多關鍵突變，如KRAS^G12C、BRAF^V600E等，以增強其臨床實用性。盡管在區分高度相似的核苷酸置換時存在挑戰，但EC-SNV-Seq為推進癌癥診斷護理標準提供了一種簡單、可擴展且高效的解決方案。

熱點排行

新聞專題