特發性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)是一種致命的慢性間質性肺病，其特點是肺部進行性、不可逆的瘢痕形成，最終導致呼吸衰竭和死亡。盡管在理解遺傳和環境風險因素方面取得了進展，但驅動纖維化的分子機制仍然難以捉摸，治療選擇僅限于減緩疾病進展。目前IPF的標準治療藥物包括吡非尼酮和尼達尼布，它們能緩解疾病進展，但生存獲益有限，診斷后中位生存期僅為3-5年。這種治療停滯凸顯了針對纖維化上游驅動因子的新策略的迫切需求。

在病理上，IPF的特征是形成由肌成纖維細胞、成纖維細胞和其他細胞類型組成的纖維化病灶，這些細胞將過量的細胞外基質(Extracellular Matrix, ECM)成分分泌到肺泡結構中，導致肺間質內大量ECM沉積、進行性氣體交換衰竭和患者死亡。在這些細胞效應器中，肺成纖維細胞來源的肌成纖維細胞是ECM失調的主要貢獻者，通過轉化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1, TGF-β1)等促纖維化介質的持續激活而發揮作用。在病理刺激下，成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，其特征是α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle Actin, α-SMA)應力纖維形成和過度分泌表型，過度產生膠原蛋白和纖連蛋白等纖維狀ECM蛋白。值得注意的是，在臨床前模型中，藥理學抑制成纖維細胞活化可顯著減輕肺纖維化，突顯了該過程作為治療關鍵點的地位。

循環蛋白質組是介導器官間通訊和組織穩態的動態蛋白質庫，已成為慢性疾病的生物標志物來源和治療靶點庫。其中，載脂蛋白因其在調節炎癥反應、氧化應激和組織重塑方面的多效性作用而在肺部疾病發病機制中日益受到關注。特別是載脂蛋白E(Apolipoprotein E, apoE)，它是血漿脂蛋白的多功能成分，通過與低密度脂蛋白受體(Low-Density Lipoprotein Receptor, LDLR)家族成員(如LRP1、VLDLR和LRP8)相互作用，協調脂質代謝和神經元修復。雖然APOE多態性是阿爾茨海默病和心血管風險的既定修飾因子，但新出現的證據表明其通過單核細胞來源的肺泡巨噬細胞參與纖維化消退。然而，血漿apoE水平與肺纖維化之間的因果關系，特別是其對成纖維細胞活化的調節作用，仍未得到探索。

為了回答這些問題，研究人員開展了一項整合了多組學數據集薈萃分析、兩樣本孟德爾隨機化(Mendelian Randomization, MR)和跨物種實驗驗證的研究，以確定血漿apoE在IPF發病機制中的因果作用。該研究發表于《Journal of Advanced Research》，揭示了血漿apoE通過雙重受體(LRP1和PLAU)的參與抑制TGF-β/Smad驅動的成纖維細胞活化，最終減輕纖維化重塑。此外，研究人員還確定了RGX-104，一種小分子肝X受體(Liver X Receptor, LXR)激動劑，作為APOE軸的藥理學激活劑，可在小鼠模型和人肺切片中減輕纖維化。這項工作將血漿apoE確立為IPF的潛在診斷生物標志物和治療靶點，彌合了遺傳流行病學與轉化發現之間的差距。

本研究采用了多組學整合與跨物種驗證的策略。首先，研究人員對7個血漿隊列和2個組織隊列進行了薈萃分析，并結合兩樣本孟德爾隨機化分析，以評估血漿蛋白與IPF風險的因果關聯。其次，利用CRISPR/Cas9技術構建了APOE基因敲除(APOE-KO)犬和Apoe^-/-小鼠模型，以研究apoE缺失對肺纖維化的影響。在機制探索方面，運用單細胞轉錄組學技術分析了人肺組織細胞圖譜，以鑒定成纖維細胞富集的apoE受體；采用SPIDER技術結合表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)來表征新的apoE相互作用蛋白。在治療潛力驗證方面，在博來霉素(Bleomycin, BLM)誘導的小鼠肺纖維化模型和人肺切片(Precision-Cut Lung Slices, PCLS)中，測試了LXR激動劑RGX-104的治療效果。此外，還通過免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)、分子對接、蛋白質印跡(Western Blot, WB)和免疫熒光等技術，深入闡明了apoE通過LRP1和PLAU雙受體抑制TGF-β/Smad信號通路的分子機制。

為了系統研究IPF的蛋白質組學圖譜，研究人員對28項研究進行了薈萃分析，包括7個基于血漿的隊列(761名參與者；488名IPF患者 vs 273名對照)。血漿蛋白質組學分析揭示了431個差異表達蛋白，其中血漿apoE在IPF患者中顯著降低。為了建立因果關系，研究人員進行了兩樣本MR分析，利用順式蛋白數量性狀位點(cis-pQTLs)作為工具變量。MR分析揭示了18種與IPF風險相關的因果血漿蛋白：9種保護因子和9種風險增強因子。值得注意的是，血漿apoE在分析中表現出一致的保護作用，使其成為最穩健的候選因子。此外，MR分析還顯示，基因決定的apoE水平升高與肺功能改善(如FEV1和FVC)呈正相關，并抑制了促纖維化介質MIP-1β/CCL4和bFGF的水平。在一項包含32名健康對照、32名間質性肺病(ILD, 非IPF)患者和24名IPF患者的多組隊列研究中，驗證了血漿apoE水平在疾病狀態下呈進行性耗竭，IPF患者的減少最為顯著。受試者工作特征(ROC)分析表明，血漿apoE對IPF的識別具有優越的判別能力。

為了建立人類研究中觀察到的apoE與IPF之間的因果關系，研究人員通過CRISPR/Cas9編輯和體細胞核移植克隆，生成了APOE敲除(APOE-KO)犬。令人驚訝的是，APOE-KO犬在24月齡時表現出自發性肺纖維化病變。蘇木精-伊紅(H&E)染色顯示，純合APOE-KO犬的肺泡結構顯著喪失和紊亂。Masson三色染色顯示，純合APOE-KO犬肺中膠原沉積和纖維化重塑增加。免疫組織化學分析顯示，與野生型對照相比，純合APOE-KO犬中α-SMA、膠原蛋白1和纖連蛋白的陽性區域擴大。分子譜分析證實，純合APOE-KO犬在蛋白和轉錄水平上均協調上調了纖維化標志物。這些發現共同證明，apoE在保護大型哺乳動物免受肺纖維化方面發揮著不可或缺的作用。

研究人員進一步采用博來霉素(BLM)誘導的小鼠模型來檢測纖維化進展過程中apoE水平的動態變化。ELISA結果顯示，在纖維化進展過程中，血清apoE水平呈進行性降低，同時肺中apoE蛋白和mRNA表達也降低。為了進一步描繪apoE在肺纖維化中的保護作用，研究人員通過CRISPR-Cas9技術生成了Apoe敲除(Apoe^-/-)小鼠，并使其接受BLM誘導的肺纖維化。與WT對照相比，BLM誘導的Apoe^-/-小鼠表現出更大的病變區域。Masson三色染色切片的組織病理學定量證實，BLM誘導的Apoe^-/-小鼠膠原沉積加重。此外，在纖維化嚴重程度標志物羥脯氨酸水平上也得到了類似的結果。分子譜分析顯示，BLM誘導的Apoe^-/-小鼠在蛋白和轉錄水平上均協調上調了纖維化標志物，免疫組織化學圖譜顯示BLM誘導的Apoe^-/-小鼠中α-SMA、膠原蛋白1和纖連蛋白陽性區域擴大。在BLM誘導后第14天和第18天，治療性靜脈注射重組apoE蛋白(0.3 mg/kg)顯著減少了WT和Apoe^-/-小鼠的肺膠原沉積。該治療同時抑制了WT和Apoe^-/-小鼠中關鍵纖維化標志物的表達。這種表型拯救證實了apoE在減輕纖維化重塑中的功能作用。

為了闡明apoE介導的肺纖維化減輕的細胞靶點和分子機制，研究人員對來自對照和IPF肺的整合單細胞RNA-seq數據集進行了分析。無監督聚類揭示了21個不同的細胞群，顯示IPF患者中肌成纖維細胞顯著擴增，同時成纖維細胞比例減少，表明成纖維細胞向肌成纖維細胞轉變。對apoE受體表達模式的系統評估顯示，LDLR和LRP1在肺中主要表達，而LRP8和VLDLR的檢測極少。細胞類型特異性分析顯示，LDLR在肺泡2型上皮細胞(AT2)中富集，而LRP1主要在成纖維細胞和肌成纖維細胞中表達，表明通過這些不同的細胞靶點可能存在雙重調節途徑。功能驗證實驗表明，apoE給藥顯著減弱了TGF-β誘導的MRC-5細胞成纖維細胞活化，表現為α-SMA、膠原蛋白1和纖連蛋白蛋白表達以及相應mRNA水平的降低。值得注意的是，apoE未能調節BLM誘導的A549細胞上皮損傷反應，確立了成纖維細胞特異性LRP1靶向作為其主要抗纖維化機制。

盡管發現了LRP1依賴的apoE活性，但在MRC-5細胞中敲低LRP1部分減弱但并未消除apoE對成纖維細胞活化標志物的抑制作用，表明存在替代受體的參與。利用SPIDER技術，研究人員確定了纖溶酶原激活物尿激酶(Plasminogen Activator Urokinase, PLAU)是成纖維細胞中一種新的apoE相互作用蛋白。此外，單細胞數據顯示，在肺組織的21種不同細胞類型中，PLAU主要在肌成纖維細胞中表達，在IPF患者中表達水平高于健康對照。通過SPR進行的生物物理學驗證證明了apoE-PLAU的強結合。分子對接模擬和HEK293T細胞中的免疫共沉淀進一步支持了這一點。功能研究表明，PLAU敲低加劇了成纖維細胞活化，而雙重LRP1/PLAU耗竭產生了協同效應，證實了協同受體參與。

對TGF-β處理的MRC-5細胞進行RNA-seq分析顯示，通過主成分分析(PCA)進行不同的聚類，KEGG分析表明抑制TGF-β信號通路是apoE的主要機制。與抑制經典TGF-β信號通路一致，apoE在MRC-5和HLF細胞中抑制了TGF-β誘導的SMAD2/3磷酸化(p-SMAD2/3)以及下游基因(包括膠原蛋白1和PAI1)的表達。免疫熒光進一步證實了這種抑制作用，顯示apoE減輕了TGF-β誘導的MRC-5細胞中p-SMAD2/3和SMAD4的核轉位。機制驗證表明，單個LRP1或PLAU敲低部分恢復了p-SMAD2/3、膠原蛋白1和PAI1的水平，而雙重敲低更有效地抵消了apoE在MRC-5和HLF細胞中的抑制能力，證實apoE協調地靶向這兩種受體以阻斷TGF-β/Smad驅動的成纖維細胞活化。

為了將apoE的治療潛力轉化為臨床應用，研究人員對UKB中的784種疾病/性狀進行了Phe-MR分析。這確定了18種在多重檢驗校正后與血漿apoE水平顯著相關的結果。通過ChEMBL和ClinicalTrials.gov進行的系統藥物發現評估揭示了四種apoE靶向化合物。RGX-104被選為系統評估其抗纖維化潛力的候選藥物，因為它被表征為一種小分子LXR激動劑，可轉錄激活APOE表達。

在BLM誘導的模型中，RGX-104(40 mg/kg，在BLM誘導后第14天和第18天腹腔注射)激活LXR信號不僅恢復了循環和肺中apoE的水平，還上調了其下游靶點Abca1和Abcg1的表達。組織病理學分析表明，RGX-104治療后膠原沉積和肌成纖維細胞活化顯著減少。RGX-104同時抑制了BLM誘導的促纖維化bFGF的增加。從機制上講，RGX-104減弱了BLM誘導的纖維化小鼠肺中成纖維細胞內TGF-β信號的激活，表現為p-Smad3信號的顯著減少。至關重要的是，RGX-104的抗纖維化作用在Apoe敲除小鼠中被消除，證實了LXR-APOE軸的依賴性。進一步分析顯示，RGX-104有利地調節了纖維化小鼠的膽固醇代謝，降低了血清LDL-C并升高了HDL-C。

為了評估臨床可轉化性，研究人員采用了一種人離體肺纖維化模型，用促纖維化混合物刺激人PCLS。RGX-104治療激活了LXR信號，恢復了apoE水平，并顯著降低了纖維化標志物α-SMA、膠原蛋白I和纖連蛋白的表達。從機制上講，RGX-104有效抑制了混合物誘導的人PCLS中成纖維細胞內TGF-β信號的激活。這些在鼠類和人類離體模型中保守的反應強調了RGX-104通過apoE介導的途徑調節治療IPF的潛力。

本研究通過整合人類遺傳學、多組學和跨物種實驗，確立了血漿apoE是抵抗適應性不良纖維化重塑的核心守護者。對其通過雙重受體介導的TGF-β/Smad信號抑制的機制闡明，加上RGX-104的治療效果，為IPF中apoE靶向治療提供了轉化路線圖。這些進展不僅加深了我們對纖維化發生的理解，也展示了整合方法在彌合分子發現與臨床應用方面的力量。

該研究的優勢在于其整合方法，結合了觀察性研究的薈萃分析、MR和跨物種實驗。據我們所知，這是對IPF患者進行的首次全面蛋白質組學分析，確定了431種疾病相關的血漿蛋白。然而，觀察性研究本身無法確定因果關系。通過將薈萃分析與兩樣本MR相結合，研究人員確定了血漿apoE是IPF的穩健保護因子。進一步的MR分析揭示了血漿apoE對肺功能的益處以及促纖維化細胞因子水平的降低，共同支持了apoE的治療潛力。

本研究的一個關鍵創新是通過大型和小型動物模型對APOE功能進行跨物種驗證。令人驚訝的是，APOE缺陷犬自發地出現了肺纖維化病變，而Apoe^-/-小鼠則表現出加重的BLM誘導的纖維化。這種在系統發育上不同物種間保守的纖維化加劇，強調了apoE在維持肺穩態方面的進化作用。

本研究揭示了PLAU是一種新的apoE相互作用蛋白，擴展了對apoE受體的經典理解，超越了LDLR家族成員。PLAU產生的纖溶酶具有廣泛的底物特異性，纖溶酶原激活系統與急性肺損傷(ALI)和肺纖維化有關。新出現的證據表明，間質PLAU產生的纖溶酶通過涉及蛋白酶激活受體-1(PAR-1)和其他途徑的機制在IPF中發揮強效促纖維化作用。PLAU激活纖溶酶原形成纖溶酶，纖溶酶可以直接或間接通過基質金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)的級聯反應降解ECM成分，并切割/激活ECM結合的潛伏TGF-β，從而增加活性TGF-β的局部水平并驅動纖維化反應。此外，研究表明可溶性PLAU水平可以改變免疫細胞和基質細胞的功能，表明PLAU-纖溶酶軸不僅通過蛋白水解激活TGF-β，還通過調節細胞信號傳導和炎癥微環境來促進纖維化。矛盾的是，IPF患者在BALF中表現出PLAU水平降低，同時纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI1)濃度升高。值得注意的是，鼻內給予超生理劑量的PLAU或支氣管Clara細胞中上皮特異性PLAU過表達增強了肺泡纖溶活性，在實驗性肺損傷模型中顯示出保護作用。這些發現共同表明PLAU在ALI和IPF進展中的作用具有背景依賴性。我們的研究結果表明，成纖維細胞中apoE-PLAU相互作用抑制了TGF-β/Smad驅動的活化，揭示了纖溶與肺纖維化之間未被充分認識的相互作用。

雖然先前的工作將apoE-LRP1信號傳導與巨噬細胞介導的膠原吞噬聯系起來，但我們建立了一個以成纖維細胞為中心的機制，其中雙重LRP1/PLAU的參與協同抑制TGF-β/Smad信號傳導，闡明了一個用于抗纖維化干預的新軸。LRP1和PLAU協同抑制TGF-β信號傳導的機制基礎可能涉及以下方面：一方面，apoE可以同時直接結合PLAU和LRP1。這種雙重受體共占據/復合物的形成可能富集了膜或TGF-β信號復合物胞質區域的apoE介導的抑制信號，從而放大了對Smad磷酸化的抑制。另一方面，LRP1是一種多功能清道夫和信號傳導受體，識別至少30種不同的配體，特別是包括apoE和PLAU。與細胞表面受體結合后，配體可被LRP1識別并內化到早期內體-溶酶體途徑中。apoE與PLAU的結合可能抑制PLAU的細胞外蛋白水解活性，并將apoE-PLAU復合物重定向到LRP1介導的內存途徑中，從而減少局部活性TGF-β的產生，并放大對TGF/Smad信號傳導的抑制。

基于Theobald等人的發現，我們研究對apoE介導的成纖維細胞抑制的關注得到了其巨噬細胞適應作用的新證據的補充。他們的工作表明，β-葡聚糖誘導的、Dectin-1/CARD9依賴的ApoE⁺CD11b⁺單核細胞來源的肺泡巨噬細胞的產生增強了細菌清除并改善了體內纖維化。這些ApoE依賴性巨噬細胞是糖酵解性的、具有吞噬性，并且在再刺激時產生高水平的IL-6。這強調了apoE可能通過成纖維細胞內在和巨噬細胞介導的機制促進肺恢復力的平行途徑，從而拓寬了apoE在IPF中的治療相關性。

LXR激動劑RGX-104已成為挽救apoE表達和減輕鼠類和人類肺模型中纖維化的潛在治療候選藥物。研究表明，RGX-104通過轉錄激活APOE來重塑酸性腫瘤微環境，從而減少髓源性抑制細胞(Myeloid-Derived Suppressor Cell, MDSC)浸潤以增強抗腫瘤免疫。盡管該藥物目前正在進行針對晚期肺癌和子宮內膜癌的I期臨床試驗，但其在肺纖維化背景下的治療潛力仍未得到探索。我們的研究開創了其在肺纖維化中的應用。然而，眾所周知，LXR激活會促進肝臟脂質積累，這對RGX-104治療IPF的臨床應用構成了重大限制。未來評估RGX-104在IPF患者中的臨床試驗必須包括嚴格的肝臟監測。

我們的研究存在幾個局限性。首先，我們的研究結果表明，血漿apoE不僅在IPF中顯著降低，在非IPF的ILD中也顯著降低。鑒于我們驗證隊列的規模較小，未來需要進行更大規模的研究來確認apoE對IPF的診斷效用，并進一步區分IPF與其他ILD。其次，盡管我們描繪了apoE通過雙重受體(LRP1/PLAU)依賴性抑制TGF-β/Smad驅動的成纖維細胞活化的機制，但這些受體之間精確協調的分子相互作用需要進一步闡明。第三，盡管RGX-104在鼠類模型和人類PCLS中顯示出有希望的抗纖維化功效，但依賴這些系統可能無法完全再現人類IPF的復雜性，特別是其動態的免疫細胞募集動力學。