《Research in Veterinary Science》：Establishment of detection method of chicken infectious anemia virus based on CRISPR/Cas12a system
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chicken infectious anemia virus (CIAV)檢測技術，通過優化CRISPR/Cas12a系統結合酶促重組酶擴增（ERA），建立了高靈敏度熒光檢測（1 copy/μL）和快速側流層析檢測（103 copies/μL，30分鐘出結果），無交叉反應，適用于基層和資源有限地區。
陳晨生|王靜芳|譚夢圓|張靜文|孫夢然|孫久夢|邵穎|涂健|朱良強|宋向軍
中國安徽省農業大學動物科學技術學院獸醫病理生物學與疾病控制重點實驗室，合肥230036
摘要
雞傳染性貧血病毒（CIAV）會導致雞傳染性貧血，其特征是貧血和免疫功能障礙。該病毒的快速傳播給家禽生產者帶來了巨大的經濟損失。
CRISPR/Cas12a系統通過crRNA引導的目標識別和Cas12a的旁分泌活性被廣泛用于病毒檢測。為了實現雞傳染性貧血病毒（CIAV）的快速和高靈敏度檢測，我們改進了一種基于CRISPR-Cas12a的熒光檢測方法。通過優化CRISPR/Cas12a系統并整合酶促重組擴增（ERA）技術，該檢測方法的靈敏度達到了1拷貝/μL，顯示出其在CIAV診斷中的顯著實用性。此外，我們還開發并優化了一種CRISPR/Cas12a側向流動檢測方法，其靈敏度達到10^3拷貝/μL，能夠快速直觀地檢測目標分析物。該技術對CIAV具有高度特異性，不會與其他雞病毒發生交叉反應。總體而言，該系統使用成本效益高的設備實現了CIAV的快速檢測，適用于病毒監測。
引言
雞傳染性貧血病毒（CIAV）是導致雞傳染性貧血（CIA）的病原體，對家禽養殖業構成了嚴重威脅（Oluwayelu等人，2005年）。該疾病表現為貧血、淋巴組織萎縮和免疫抑制，可能導致較高的死亡率。CIAV通過垂直傳播和水平傳播途徑擴散。感染病毒的雞免疫力下降，容易受到二次感染，死亡率增加。過去十年中，該病毒的持續傳播對亞洲經濟產生了重大影響，并給家禽產業帶來了嚴峻挑戰（Daniel Todd等人，1990年；Lai等人，2013年；Vaziry等人，2011年）。目前針對CIAV的研究主要集中在遺傳特征分析和進化研究上；然而，缺乏能夠支持高效病毒分離的細胞系是一個關鍵限制，阻礙了對CIAV發病機制的系統研究。此外，有效的抗病毒策略和疫苗接種方案尚未完善，嚴重限制了疾病控制和預防工作。因此，本研究旨在開發一種結合高靈敏度、快速性和現場適用性的CIAV檢測技術，以克服傳統方法的局限性。盡管間接酶聯免疫吸附試驗（ELISA）能夠快速檢測CIAV抗體（康奈爾大學獸醫學院微生物學和免疫學系，伊薩卡，2002年；Kye等人，2013年），但由于分析靈敏度不足和與相關病原體的交叉反應，其在早期診斷中的應用受到限制。因此，由于其高分析靈敏度和特異性，聚合酶鏈反應（PCR）和定量實時熒光PCR（qPCR）等分子診斷方法被廣泛用于CIAV檢測（Kato等人，2007年；Shmakov等人，2017年；Yan等人，2014年）。然而，這些方法在實地應用中受到昂貴儀器和專業技術的限制（Eisen等人，2005年；Fonfara等人，2016年；Wu等人，2020年）。這些局限性凸顯了開發快速、低成本、高靈敏度的CIAV檢測平臺的重要性，以實現有效的病原體監測和流行病學追蹤。在本研究中，我們使用CRISPR/Cas12系統進行了基于ERA的快速檢測，降低了成本，并能夠在偏遠和經濟條件較差的地區進行疾病檢測（Wang等人，2020a；Yu等人，2023年）。
我們設計了針對VP2基因保守區域的特異性crRNA、探針和ERA引物。為滿足快速、低成本和高靈敏度檢測的需求，我們將CRISPR/Cas12a系統與酶促重組擴增（ERA）技術結合，開發了一種ERA-CRISPR/Cas12a熒光檢測方法。該方法的分析靈敏度達到了1拷貝/μL，且不與其他禽類病毒發生交叉反應。為克服對復雜儀器的依賴，我們進一步結合了側向流動條檢測技術，實現了10^3拷貝/μL的靈敏度，并在30分鐘內獲得檢測結果。總之，CRISPR/Cas12a和ERA技術的協同整合克服了傳統CIAV檢測方法的局限性，這些方法傳統上依賴于復雜的儀器和專業技術人員（Wang等人，2020b；Wei等人，2022年）。我們評估了該方法的靈敏度、特異性和臨床樣本檢測能力，以評估其可行性。這項研究為早期CIAV監測和流行病學調查提供了技術支持，提供了一種適用于基層和資源有限環境的時間高效、低成本的檢測方法（Zhang等人，2021年）。
部分內容摘錄
引物和crRNA的制備
根據制造商說明，使用TIANamp病毒DNA/RNA試劑盒（北京天根生物技術有限公司）提取病毒核酸。根據供應商的說明，將CIAV病毒的RNA基因組轉化為cDNA/DNA。所得的病毒基因組cDNA/DNA儲存在-80°C條件下待進一步使用。序列分析使用MegAlign軟件（DNASTAR公司，美國威斯康星州麥迪遜）。可視化ERA-Cas12a系統的構建
我們開發了基于CRISPR/Cas12a的CIAV檢測系統ERA-CRISPR/Cas12a，該系統結合了熒光檢測和側向流動條讀數功能。為了篩選最合適的ERA引物，對純化的擴增產物進行了凝膠電泳分析。僅有一對引物（VP2-ERA-F2和VP2-ERA-R2）產生了明顯的條帶。目標片段大小為279 bp，與預期分子量一致（圖1，A和B）。
討論
CIAV的出現和快速全球傳播對全球家禽產業造成了巨大損失。研究表明，CIAV感染會導致淋巴組織萎縮、免疫功能受損和潛在的死亡風險（Chen等人，2023年）。目前CIAV的管理策略受到缺乏有效疫苗和治療干預措施的制約，使得疾病控制主要依賴于早期的分子診斷。
新穎性聲明
在本研究中，我們創新性地優化了CRISPR/Cas12a系統，結合酶促重組擴增（ERA）技術用于雞傳染性貧血病毒（CIAV）的診斷，并在此基礎上建立了CRISPR/Cas12a熒光檢測方法和CRISPR/Cas12a側向流動條檢測方法。此外，我們確認該技術與其他雞病毒無交叉反應，表明其具有良好的特異性。
作者貢獻聲明
陳晨生：撰寫初稿、研究、數據管理。
王靜芳：撰寫初稿、研究、數據管理。
譚夢圓：研究、數據管理。
張靜文：撰寫初稿、數據管理。
孫夢然：研究、數據管理。
孫久夢：撰寫、審稿與編輯。
邵穎：撰寫、審稿與編輯。
涂健：撰寫、審稿與編輯。
朱良強：撰寫、審稿與編輯。
宋向軍：撰寫、審稿與編輯。
利益沖突聲明
倫理批準和參與同意：本研究未使用活體動物。利益聲明：無。科學寫作中未使用生成式AI。
致謝
本工作得到了
IHM食品營養與健康聯合研究中心研究基金（2024SJY04）和
安徽省優秀青年人才支持計劃（YQYB2023001）的資助。
