《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Establishing a Chimeric tRNA-sgRNA Scaffold and Computational Basis for Enhanced CRISPR Interference
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CRISPR/Cas9系統基因編輯效率受sgRNA穩定性與表達水平影響顯著，本研究構建了整合Sephadex aptamer-HBV ε tRNA支架的sgRNA（SeptgRNA），通過結構模擬驗證其增強sgRNA穩定性及dCas9三元復合物作用機制，在ampC和ompA基因敲低實驗中展現出更優的基因抑制效果。
作者：金潔琳|楊晨軒|鄧琴琴|吳龍江|陳旺|陳卓穎
陜西科技大學生物科學與工程學院，中國陜西漢中723000
摘要
CRISPR/Cas9系統徹底改變了基因組工程領域，然而優化單導向RNA（sgRNA）的穩定性和表達水平對于實現更有效的基因調控至關重要。轉運RNA（tRNA）因其固有的穩定性而成為一種有價值的解決方案。在這項研究中，我們通過將sgRNA整合到Sephadex適配體-人HBV ε tRNA（SeptRNA）支架的反密碼子莖部中，開發了一種嵌合tRNA-sgRNA（tgRNA），從而形成了SeptgRNA。當用于靶向大腸桿菌的ampC和ompA基因時，SeptgRNA的積累量顯著高于傳統的sgRNA。為了克服tRNA支架可能帶來的空間阻礙，我們通過將SeptgRNA與失活的Cas9（dCas9）共表達來利用CRISPR干擾（CRISPRi），這有效地抑制了DNA轉錄。這種方法比傳統的基于sgRNA的CRISPRi顯示出更強的基因表達抑制效果。分子對接和分子動力學模擬表明，SeptRNA支架穩定了sgRNA的莖環結構，并增強了dCas9-tgRNA-DNA三元復合物的穩定性。我們的發現為使用嵌合tgRNA進行基因敲低提供了概念驗證，突顯了它們在提高表達水平和增強穩定性方面的潛力。這項研究進一步豐富了CRISPR/Cas9工具箱，并強調了tRNA支架在基因工程應用中的多功能性。
引言
成簇規律間隔短回文重復序列/CRISPR相關蛋白9（CRISPR/Cas9）系統徹底改變了基因組工程領域，是近幾十年來生命科學領域最具變革性的進展之一。該系統包括Cas9核酸酶、轉激活crRNA（tracrRNA）和crRNA。Doudna及其同事的一項開創性工作是將雙tracrRNA：crRNA工程化為單導向RNA（sgRNA）[1]，從而指導Cas9通過其HNH和RuvC樣核酸酶結構域識別并切割目標雙鏈DNA [2]。CRISPR/Cas9介導的基因組編輯效率在很大程度上取決于sgRNA的拷貝數和長度 [3]、[4]、[5]。研究表明，提高sgRNA的穩定性和表達水平不僅可以減少脫靶效應，還可以增加目標DNA的切割效率 [6]、[7]。這突顯了開發提高sgRNA穩定性和可用性策略的重要性，從而提升CRISPR/Cas9系統在基因組工程中的效率。
轉運RNA（tRNA）由于其緊湊的三維結構而具有固有的穩定性 [8]，能夠抵抗降解并促進融合RNA序列在體內的積累 [9]、[10]。tRNA與sgRNA的融合最早在2015年得到報道 [11]。該系統依賴于側翼tRNA的處理來釋放sgRNA，在多種模型中表現出高效率，包括在木霉（Trichoderma reesei）[12]和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[13]中的多重基因編輯。
然而，這些系統依賴于tRNA的側翼序列來釋放sgRNA，忽略了tRNA支架在RNA穩定性方面的結構優勢。本研究提出了一種新概念，即利用Sephadex適配體-人HBV ε tRNA（SeptRNA）支架本身來構建嵌合SeptRNA-sgRNA（SeptgRNAs）（圖1）。這種策略充分利用了SeptRNA支架的優勢，超越了傳統的串聯融合方式。通過模仿天然tRNA結構，SeptRNAs能夠被細胞機制有效處理，從而提高穩定性和表達水平 [14]。此外，SeptRNA支架可以整合長達300個核苷酸的結構化RNA插入片段而不破壞其折疊完整性，使得sgRNA序列能夠穩定嵌入 [15]。通過將特定的sgRNA序列整合到反密碼子莖部，我們保持了SeptRNA支架的結構完整性，并提高了sgRNA的產量和穩定性。我們使用了針對大腸桿菌ampC和ompA基因的sgRNA，這兩個基因位點已被廣泛研究，分別用于評估CRISPRi的效率，并且之前已經研究了它們在氨芐青霉素抗性和噬菌體相互作用中的作用 [16]。ampC基因編碼AmpC β-內酰胺酶，這種酶通過水解β-內酰胺類抗生素來賦予抗生素抗性，其表達受AmpR和細胞壁回收中間產物的調控 [17]、[18]。ompA基因編碼OmpA，這是一種多功能的外膜蛋白，對維持膜完整性、細胞粘附、免疫逃避、營養吸收和接合質粒轉移至關重要 [19]、[20]。鑒于SeptRNA支架在sgRNA引導的Cas9活性過程中可能帶來的空間阻礙，我們將研究重點從基因敲入和敲除轉向了CRISPR干擾（CRISPRi）。這是通過將SeptgRNA嵌合體與失活的Cas9（dCas9）共表達來實現的。分子對接分析進一步闡明了SeptRNA在穩定sgRNA構象和沉默目標基因方面的作用，證明了其在有效基因組調控中的能力。
在這項研究中，我們專注于開發一種嵌合SeptgRNA，以提高sgRNA的穩定性和表達水平。通過使用這兩個針對ampC和ompA基因的sgRNA作為模型，我們為嵌合SeptgRNA在基因敲低中的應用提供了概念驗證。該策略旨在評估SeptgRNA在CRISPRi介導的基因抑制中的有效性，并通過分子對接和分子動力學（MD）模擬獲得結構上的見解。這項工作顯著增強了CRISPR/Cas9工具箱的功能，豐富了其在基因調控中的應用范圍。
部分摘要
質粒構建
我們使用雙質粒CRISPR/Cas系統來生產dCas9和各種RNA引導序列 [21]。pCas載體（Addgene # 62225）通過定點突變試劑盒（TOYOBO有限公司，大阪，日本）進行了改造，將Asp10和His840替換為丙氨酸，生成了pdCas變體（圖3A），該載體在其天然啟動子控制下表達dCas9。對于sgRNA的表達，我們使用了相應的引導序列N20
通過SeptRNA支架增強sgRNA的表達
我們首先將編碼SeptRNA的DNA引入pTargetT載體，并使用大腸桿菌宿主進行表達（圖S1A）。對于較大的嵌合SeptgRNA，我們優化并使用了5%的變性尿素-PAGE電泳。在這種凝膠濃度下無法分辨SeptRNA，但在轉化了pTarget-tg-ampC和pTarget-tg-ompA的細胞中觀察到了約260個核苷酸大小的明顯條帶（圖S2A），表明嵌合SeptgRNA得到了成功表達。盡管在尿素-PAGE上的條帶較淡，但Northern印跡分析顯示...
討論
CRISPR/Cas9系統已被廣泛用于基因組操作，包括基因破壞 [37]、轉錄調控 [38] 和表觀遺傳修飾 [39]；然而，它面臨著顯著的脫靶效應 [40]、[41]、[42]。已經開發了幾種策略來減輕這些效應，主要是通過修改Cas9蛋白本身來實現。這些策略包括使用核酸酶或Cas9的變體 [43]、將DNA結合結構域與Cas9融合 [44]、[45] 等。
結論
在這項研究中，我們設計了一種嵌合SeptgRNA，以提高CRISPR干擾系統中sgRNA的穩定性和表達水平。SeptRNA支架顯著增強了sgRNA的積累，并增強了ampC和ompA基因的抑制效果，分子對接和分子動力學模擬進一步表明了sgRNA結構以及dCas9-tgRNA-DNA復合物的穩定性。這項工作確立了SeptgRNA作為一種有效的RNA支架策略，為未來的研究奠定了基礎
作者貢獻聲明
陳卓穎：撰寫 – 審稿與編輯。吳龍江：撰寫 – 審稿與編輯、監督、概念構思。鄧琴琴：撰寫 – 審稿與編輯。楊晨軒：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、實驗研究。金潔琳：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、數據可視化、實驗研究、數據分析。陳旺：撰寫 – 審稿與編輯數據可用性
數據包含在手稿中。
資金來源
本研究未獲得公共部門、商業機構或非營利組織的任何特定資助。
利益沖突聲明
作者們沒有需要聲明的利益沖突。
