《Horticultural Plant Journal》：In utero gene therapy: Pioneering diagnostic and therapeutic technologies
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先天性疾病的產前診斷與基因治療進展綜述，涵蓋技術如熒光原位雜交、染色體微陣列分析，基因編輯技術CRISPR/Cas9的挑戰與前景，納米技術在靶向治療中的應用，以及倫理問題。
作者：Shalmoli Seth、Malini Sen、Souvik Banerjee、Ritamay Sau、Somasree Ray
印度西孟加拉邦Durgapur的B.C. Roy藥學與相關健康科學學院
摘要
產前成像、分子診斷和基因篩查技術的進步極大地改變了先天性疾病的處理方式，使得在子宮內就能實現早期識別和治療。這些創新使得在臨床癥狀出現之前就可以進行醫療干預，從而改善了治療效果并減少了疾病的嚴重程度。通過對血液、組織和其他生物樣本進行先進的基因檢測，并結合熒光原位雜交和染色體微陣列分析等技術，可以精確地檢測和分類單基因、線粒體、染色體和多因素疾病。新興的子宮內療法，特別是基因療法，利用胎兒獨特的發育特性，為結構和基因異常提供有針對性和最小侵入性的治療。然而，仍存在一些關鍵挑戰，例如確保生物相容性和實現高效的細胞內轉基因傳遞。病毒和非病毒傳遞系統的進展以及基因編輯技術的進步為克服這些障礙帶來了希望，為臨床應用鋪平了道路。納米技術通過提供可定制的、穩定的平臺，用于特定階段和組織的目標干預，進一步增強了這些努力，擴大了成功的子宮內治療范圍。總體而言，這些產前診斷和治療策略的進步為在疾病起源階段解決先天性障礙提供了機會，顯著改善了長期健康結果和生活質量。
引言
在全球范圍內，先天性疾病的發病率正在急劇上升。每天出生的每2000名兒童中就有1名患有嚴重的先天性或遺傳性疾病（Larson和Cohen，2006年）。根據世界衛生組織（WHO）的數據，由于疾病本身或其相關并發癥，出生時存在解剖或功能異常的嬰兒在四周大之前就會死亡（Osterman等人，無日期；Liu等人，2016年）。這些出生缺陷不僅會導致嚴重的發病率或死亡率，還會造成長期的后遺癥，包括致殘、不成比例的高醫療支出、心理壓力，最重要的是生活質量下降（Apfeld等人，2019年）。
對于檢測和治療先天性疾病的關注與日俱增。研究人員一直在努力開發早期診斷某些先天性疾病的工具。目前，通常在孕早期通過常規的絨毛取樣（CVS）獲取胎兒組織進行診斷和基因分析（Kolaitis等人，2017年）。除了CVS之外，早期羊膜穿刺術、胎盤活檢和胎兒血液取樣也是獲取胎兒細胞進行核型分析的各種侵入性超聲引導采樣方法（Surbeck和Holzgreve，2001年）。此外，對于單基因疾病或染色體異常的診斷，還使用PCR等分子生物學技術，這些技術需要胎兒血液（Rafi和Chitty，2009年）。因此，基因診斷技術的進步使得能夠識別出許多先天性疾病的突變基因和致病突變因子，為子宮內治療開辟了道路。
子宮內療法，包括胎兒手術和干細胞移植，用于治療特定的結構出生缺陷，而子宮內基因療法則可以糾正表型異常，從而治療母親子宮內的多種遺傳性疾病（Holzgreve，1997年）。與出生后療法相比，子宮內療法不僅在母親和兒童的風險-收益平衡方面具有優勢，而且由于其最小侵入性和廣泛的治療范圍也具有潛在的好處。然而，將治療基因有效且持久地傳遞到目標位置面臨重大挑戰（McClain & Flake，2016a）。因此，在本綜述中，我們重點關注了各種子宮內診斷工具和子宮內基因治療的傳遞技術，包括產前診斷方法、基因傳遞策略、新興的基因組編輯方法、轉化限制以及與遺傳和產前干預相關的倫理考慮。
子宮內基因診斷和治療利用了胎兒的獨特發育特征，如體積小、對致畸物質的免疫能力、以及來自任何器官的干細胞的高增殖能力，以實現有效的長期目標基因修復（Peranteau和Flake，2020年）。
胎兒的小體積使得可以根據每個受體的體重比例進行有效的劑量調整。在妊娠期的第二孕期，當系統基因治療技術上可行時，人類胎兒的體重僅為一歲兒童的1%。因此，小體積和較低的體重使得治療更加高效且經濟（Hartman等人，2018年）。
對于人類胎兒來說，某些身體部位和細胞更容易接觸，例如胎兒的血腦屏障（BBB），在嬰兒/新生兒中更具通透性，因此為不同的中樞神經系統細胞提供了易于攻擊的目標。Ahad A Rahim等人在其研究中嘗試評估單鏈和自互補的AAV2/9（腺相關病毒假型219）調節胎兒和新生兒神經系統并定向基因表達的能力。評估結果顯示，基因表達在胎兒和新生兒的中樞和周圍神經系統中都有發生。然而，胎兒中的表達強度高于新生兒，證明了BBB的更好通透性（Altaleb，無日期）。同樣，在另一項研究中，CNMattar等人將AAV9傳遞給小鼠，并實現了神經細胞的階段特異性轉導。結果表明，胎兒中的神經元靶向效果優于新生兒。這證明了胎兒中特定身體部位更容易被接近（Mattar等人，2013年）。此外，豐富的前體細胞和細胞的頻繁增殖特性提高了胎兒中基因編輯的可能性。
免疫系統是出生后基因治療的主要障礙。然而，多項研究表明，由于胎兒缺乏成熟的免疫系統，在產前階段進行基因沉默是成功的。例如，Charles Worth等人在其研究中旨在識別人類對Cas9蛋白的先天免疫反應。他們進行了酶聯免疫吸附試驗來檢測抗Cas9抗體的存在。發現抗金黃色葡萄球菌 Cas9和化膿性鏈球菌 Cas9的抗體在人類血清中的比例分別為78%和58%。此外，使用抗原特異性T細胞得到的結果令人滿意，從而證明了人類對Cas9的免疫反應（Charlesworth等人，2019年）。
子宮內基因治療利用了胎兒的常規發育特征，如體積小、對致畸物質的免疫能力、以及來自任何器官的干細胞的高增殖能力，以實現有效的長期目標基因修復（Peranteau和Flake，2020年）。
胎兒的小體積使得可以根據每個受體的體重比例進行有效的劑量調整。在妊娠期的第二孕期，當系統基因治療技術上可行時，人類胎兒的體重僅為一歲兒童的1%。因此，小體積和較低的體重使得治療更加高效且經濟（Hartman等人，2018年）。
對于人類胎兒，某些身體部位和細胞更容易接觸，例如胎兒的血腦屏障（BBB），在嬰兒/新生兒中更具通透性，因此為不同的中樞神經系統細胞提供了易于攻擊的目標。Ahad A Rahim等人在其研究工作中嘗試評估單鏈和自互補的AAV2/9（腺相關病毒假型219）調節胎兒和新生兒神經系統并定向基因表達的能力。評估結果顯示，基因表達在胎兒和新生兒的中樞和周圍神經系統中都有發生。然而，胎兒中的表達強度高于新生兒，證明了BBB的更好通透性（Altaleb，無日期）。同樣，在另一項研究中，CNMattar等人將AAV9傳遞給小鼠，并實現了神經細胞的階段特異性轉導。結果表明，胎兒中的神經元靶向效果優于新生兒。因此證明了胎兒中特定身體部位更容易被接近（Mattar等人，2013年）。此外，豐富的前體細胞和細胞的頻繁增殖特性提高了胎兒中基因編輯的可能性。
免疫系統是出生后基因治療的主要障礙。然而，多項研究表明，由于胎兒缺乏成熟的免疫系統，在產前階段進行基因沉默是成功的。例如，Charles Worth等人在其研究中旨在識別人類對Cas9蛋白的先天免疫反應。他們進行了酶聯免疫吸附試驗來檢測抗Cas9抗體的存在。發現抗金黃色葡萄球菌 Cas9和化膿性鏈球菌 Cas9的抗體在人類血清中的比例分別為78%和58%。此外，使用抗原特異性T細胞得到的結果令人滿意，從而證明了人類對Cas9的免疫反應的存在（Charlesworth等人，2019年）。
子宮內基因治療面臨獨特的挑戰，因為需要將基因轉移載體安全有效地傳遞給胎兒而不傷害母親[表1]。載體必須進入胎兒循環系統，同時不損害母親的健康，這需要在向胎兒轉移基因的同時盡量減少母親的暴露。病毒載體的胎盤轉運仍然不確定，需要在臨床應用前進行進一步研究（Chan等人，2019年）。
一旦進入胎兒循環系統，載體必須靶向特定組織，這是一個復雜的任務，因為胚胎組織非常接近且敏感。當前的傳遞平臺往往會導致廣泛的轉導，可能會無意中影響非目標組織（Mattar等人，2017年）。嚴格調控載體傳遞和使用組織特異性啟動子對于避免致癌或生殖系修飾等有害后果至關重要。
載體被目標組織成功攝取取決于配體與細胞表面受體之間的相互作用，隨后是內體處理（Rossidis等人，2018年）。動態的胎兒環境，包括波動的細胞膜分子、受體和組織因子，使這一過程變得復雜。胎兒的體溫略高和pH值較低也可能影響基因轉移效率。
為了達到治療效果，載體基因組必須整合到胎兒細胞內，這具有挑戰性，因為這些細胞的增殖特性極強。存在于宿主染色體外的表觀遺傳載體可能在細胞分裂過程中丟失，而整合到宿主基因組中的插入載體則存在插入突變的風險（Ricciardi等人，2018a）。盡管存在這些風險，表觀遺傳載體仍被優先用于子宮內基因編輯，以避免在切割位點的整合風險。
總體而言，優化傳遞載體以提高基因持久性和減少并發癥對于推進子宮內基因治療至關重要。
部分內容摘錄
產前診斷（PND）
在子宮內識別異常情況有助于準確管理妊娠以及產前和產后的醫療干預。它還有助于就繼續或終止妊娠做出明智的決定（Stembalska等人，2007年）。基因檢測通常幫助醫生識別胎兒以及可能將突變基因傳給后代的患者和攜帶者的潛在遺傳疾病。基因檢測應用于
病毒傳遞
臨床試驗中的基因轉移使用各種載體，根據組織趨向性、包裝能力、免疫原性和生產效率進行分類（McClain & Flake，2016b；Basude和Overton，2012；Palanki等人，2021）。裸露的DNA可以直接注射到目標組織或器官中，但它容易受到內切酶的降解。由于體積大和帶負電荷，子宮內的治療性轉基因無法直接穿過細胞膜
子宮內基因治療的最新研究進展
子宮內基因治療的最新研究進展在解決先天性疾病和預防終生健康并發癥方面顯示出巨大潛力。這種創新方法在胎兒發育早期針對遺傳疾病，提供了在出生前糾正或緩解疾病進展的潛力。通過將治療性基因傳遞給胎兒，研究人員旨在從根本原因上治療多種疾病。
CRISPR/Cas9及其對子宮內基因治療的影響
CRISPR（規律間隔短回文重復序列）/Cas9已成為當今最通用的基因組編輯平臺。這種由細菌免疫系統起源的RNA引導的核酸酶復合體利用crRNA-tracrRNA導向信號靶向并切割外源DNA，從而在定義的基因組位點進行精確編輯。在Cas9內切酶切割DNA后，細胞激活內源性DNA修復途徑來修復雙鏈斷裂（DSB）。
子宮內基因治療的限制和挑戰
盡管子宮內基因治療在出生前糾正嚴重遺傳疾病方面具有巨大潛力，但仍有許多科學、臨床和倫理限制阻礙其實際應用。其中最主要的挑戰是母親和胎兒的安全性。與出生后干預不同，子宮內基因治療涉及兩個緊密相關的患者。任何傳遞給胎兒的載體、納米顆粒或生物制劑都可能無意中進入母親的循環系統
結論
近年來，先天性及遺傳性疾病的發病率顯著上升，每天大約每2000個活產嬰兒中就有1人受到影響。這些疾病常常導致嚴重的發病率、早期死亡率、長期殘疾、巨大的醫療費用和心理壓力。因此，早期發現和治療先天性疾病變得至關重要。產前診斷技術取得了顯著進步，包括超聲波、MRI等篩查方法
CRediT作者貢獻聲明
Shalmoli Seth：撰寫——審稿與編輯，撰寫——初稿，監督，概念化。Malini Sen：撰寫——審稿與編輯，撰寫——初稿。Souvik Banerjee：撰寫——初稿。Ritamay Sau：撰寫——初稿。Somasree Ray：撰寫——審稿與編輯，監督。
未引用的參考文獻
Almeida-Porada等人，2016
Chappell等人，2024
Gonzaga等人，2008
Khandhar等人，2023
Lee等人，2005
Lisjak等人，2023
Maassel等人，2022
Mendia等人，2024
Meslin等人，2025
Mimoun等人，2023
Miyake等人，2024
Porada等人，2005
Swingle等人，2022
Themis等人，2005
Xue等人，2023
利益沖突聲明
所有作者聲明與本工作無關的利益沖突。
致謝
作者衷心感謝Gupta技術科學學院和B.C. Roy藥學與相關健康科學學院的寶貴鼓勵、深刻的反饋和在整個工作過程中的堅定支持。作者還向B.C. Roy藥學與相關健康科學學院的副教授Abhik Si博士表示衷心的感謝，他的持續指導、專業建議和堅定的激勵對此工作起到了重要作用
