《Journal of Integrative Plant Biology》：Transposable element-mediated DNA methylation of the NAC20 and NAC26 promoters led to a maternal effect on grain filling
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本文揭示了水稻中NAC20和NAC26轉(zhuǎn)錄因子通過轉(zhuǎn)座子（TE）介導(dǎo)的DNA甲基化實現(xiàn)母源印記表達（MEG），從而調(diào)控籽粒灌漿的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)，在粳稻（Japonica）品種中，NAC20/26啟動子區(qū)的TE插入導(dǎo)致父源等位基因高甲基化沉默，使其呈現(xiàn)母源特異性表達；通過基因編輯（CRISPR/Cas9）刪除這些TE可恢復(fù)雙等位基因表達，并消除粉質(zhì)胚乳（floury endosperm）表型的母系遺傳效應(yīng)。地理分布分析進一步表明，該TE插入事件與粳稻向高緯度地區(qū)（>33°N）的馴化擴張密切相關(guān)，為理解表觀遺傳調(diào)控在作物適應(yīng)性進化中的作用提供了新視角。
引言
親本來源效應(yīng)通常由母源或父源等位基因的選擇性表達引起。盡管基因組學(xué)研究提示印記基因表達主要發(fā)生在植物的胚乳中，但關(guān)于等位基因特異性表達及其與親本來源表型關(guān)聯(lián)的深入研究仍較為缺乏。NAC20和NAC26（后文合稱NAC20/26）是一對緊密連鎖的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子，在水稻胚乳中冗余調(diào)控籽粒灌漿和清蛋白積累。本研究旨在闡明NAC20/26如何通過等位基因特異性母源表達調(diào)控籽粒灌漿，并探討其表觀遺傳調(diào)控機制及其在水稻馴化適應(yīng)中的意義。
NAC20/26在ZH11中以母源效應(yīng)調(diào)控籽粒灌漿
在粳稻品種ZH11中，NAC20/26雙敲除突變體（nac20/26ZH11）表現(xiàn)出粉質(zhì)胚乳表型，這是由于淀粉和清蛋白積累減少導(dǎo)致的籽粒灌漿缺陷。遺傳雜交實驗表明，當nac20/26ZH11作為母本與ZH11雜交（nac20/26ZH11× ZH11）或自交時，所有籽粒均呈現(xiàn)粉質(zhì)胚乳；反之，當ZH11作為母本與nac20/26ZH11雜交（ZH11 × nac20/26ZH11）時，籽粒表型正常。在NAC20或NAC26雜合突變體的雜交中，正常與粉質(zhì)胚乳籽粒呈現(xiàn)1:1的分離比，表明NAC20/26以配子體母源效應(yīng)冗余調(diào)控籽粒灌漿。
NAC20和NAC26是等位基因特異性母源表達基因（MEG）
母源效應(yīng)表型通常由母源表達基因（MEG）控制。通過等位基因表達分析發(fā)現(xiàn)，在ZH11與nac20/26ZH11的正反交胚乳中，NAC20/26的母源等位基因占主導(dǎo)表達。利用ZH11與秈稻（Indica）品種NJ6之間的單核苷酸多態(tài)性（SNP）進一步驗證，當NJ6作為母本與ZH11雜交（NJ6 × ZH11）時，僅檢測到母源NJ6等位基因的表達；而當ZH11作為母本與NJ6雜交（ZH11 × NJ6）時，則檢測到雙親等位基因的表達，表明NAC20/26在粳稻中為等位基因特異性MEG。在另兩個粳稻品種（NIP）和秈稻品種（NJ6、9311）中構(gòu)建nac20/26雙突變體，僅在粳稻背景中觀察到母源效應(yīng)，證實該現(xiàn)象具有亞種特異性。
差異DNA甲基化與NAC20/26母源特異性表達相關(guān)
等位基因特異性表達常與親本特異性DNA甲基化相關(guān)。全基因組甲基化測序數(shù)據(jù)顯示，在ZH11中，NAC20和NAC26啟動子區(qū)的差異甲基化區(qū)域（DMR）在胚乳中低甲基化，而在胚胎中高甲基化。通過亞硫酸氫鹽測序發(fā)現(xiàn)，與胚胎相比，胚乳中NAC20-DMR和NAC26-DMR在所有甲基化上下文（CG、CHG、CHH）中均呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)。利用親本特異性SNP分析ZH11與NJ6正反交胚乳的DMR甲基化水平，發(fā)現(xiàn)當ZH11作為父本時，其等位基因的DMR呈現(xiàn)高甲基化；而NJ6等位基因的DMR在任何雜交組合中均保持低甲基化。在多個品種中比較甲基化水平，證實粳稻品種（ZH11、NIP）的DMR甲基化水平顯著高于秈稻品種（NJ6、9311），提示等位基因特異性表達與父源等位基因高甲基化相關(guān)。
刪除NAC20/26側(cè)翼轉(zhuǎn)座子（TE）導(dǎo)致雙等位基因表達
DNA高甲基化常發(fā)生于轉(zhuǎn)座子（TE）及其側(cè)翼區(qū)域。基因組分析發(fā)現(xiàn)，在ZH11的NAC20啟動子區(qū)存在一個MITE家族TE（ORSgTEMT00101054），在NAC26啟動子區(qū)存在兩個串聯(lián)重復(fù)的逆轉(zhuǎn)錄TE（ORSiTEMT00T00140）。PCR檢測表明，這些TE僅存在于粳稻品種（ZH11、NIP）中，而在秈稻品種（NJ6、9311）中缺失。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)同時刪除ZH11中NAC20和NAC26啟動子區(qū)的TE（獲得NAC20/26△TE株系）后，DMR的甲基化水平顯著降低。遺傳雜交實驗表明，以NAC20/26△TE作為父本與nac20/26ZH11雜交時，籽粒不再出現(xiàn)粉質(zhì)胚乳，且父源等位基因恢復(fù)表達，證明TE介導(dǎo)的DNA高甲基化是父源等位基因沉默和母源印記表達的必要條件。
NAC20/26中的TE與粳稻北向擴張相關(guān)
表達分析顯示，NAC20/26在胚乳中特異性表達，且TE刪除不改變其表達模式。對172個水稻品種的TE分布進行地理分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)粳稻品種在NAC20（65.38%）、NAC26（84.63%）或兩者（53.85%）中存在TE插入，而秈稻品種中比例極低（NAC20為14.58%，NAC26為5.21%，兩者均為2.08%）。在中國種植區(qū)分布上，所有來自北緯33°以北的東北地區(qū)品種均在NAC20/26中攜帶TE，而低緯度地區(qū)品種的TE分布則呈現(xiàn)混合狀態(tài)，提示TE介導(dǎo)的等位基因特異性表達與粳稻向高緯度地區(qū)的馴化擴張相關(guān)。
討論
本研究首次證實了TE介導(dǎo)的DNA甲基化直接導(dǎo)致NAC20/26父源等位基因沉默，從而建立其母源印記表達模式，并調(diào)控籽粒灌漿的母系遺傳。該機制在粳稻中的特異性存在可能與其向高緯度環(huán)境的適應(yīng)有關(guān)。不同于經(jīng)典的RdDM（RNA-directed DNA methylation）途徑，NAC20/26的TE甲基化可能通過獨立機制實現(xiàn)。這一發(fā)現(xiàn)為理解表觀遺傳變異在作物馴化中的貢獻提供了新的案例，并提示中性進化理論可能部分解釋印記基因的起源。未來研究可進一步探討NAC20/26印記表達對稻米品質(zhì)和環(huán)境適應(yīng)的具體影響。
