一種次優的PAM驅動的單管CRISPR/Cas12a檢測方法，可實現無需提取樣本且超快速地檢測非洲豬瘟病毒
《Sensors and Actuators B: Chemical》：A suboptimal PAM-driven one-tube CRISPR/Cas12a assay for extraction-free and ultra-rapid detection of African swine fever virus
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時間：2026年01月02日
來源：Sensors and Actuators B: Chemical 7.7
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非洲豬瘟病毒快速檢測方法sCRAM整合無提取核酸釋放與PAM介導CRISPR/Cas12a-MIRA等溫擴增，20分鐘內實現單拷貝靈敏度，特異性100%，適用于現場診斷。
李曉輝|聶友|費思涵|文銀忠|雷琦|楊波|張丁|牛瑞燕|孫子龍
山西農業大學獸醫學院，中國晉中030801
摘要
非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的一種高度傳染性的豬病，其特征是接近100%的死亡率。由于缺乏有效的疫苗或治療方法，目前的控制策略嚴重依賴于早期檢測和迅速撲殺受感染的動物。在這里，我們開發了一種名為sCRAM（suboptimal protospacer adjacent motif (PAM)-mediated CRISPR RNA and Cas12a nuclease combined with multienzyme isothermal rapid amplification）的快速診斷平臺，該平臺能夠在20分鐘內檢測出ASFV。sCRAM結合了快速核酸釋放步驟（40°C，5分鐘）和多酶等溫擴增（MIRA）以及次優PAM介導的CRISPR/Cas12a系統（37°C，15分鐘），無需儀器即可通過紫外光或側向流動條（LFS）進行可視化讀數。sCRAM顯示出單拷貝檢測的靈敏度，并且與五種常見的豬病原體（PRRSV、PPV、JEV、PCV和PRV）沒有交叉反應。對111個模擬樣本和臨床樣本（包括血液、血漿和拭子）的評估顯示，紫外光讀數的符合率為100%，側向流動條讀數的符合率為98.20%，兩種方法的特異性均為100%。sCRAM的簡單性、快速性和現場適應性凸顯了其在資源有限環境中的潛力，為ASFV的分布式監測提供了強大的工具。
引言
非洲豬瘟（ASF）是一種高度傳染性的病毒性疾病，由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染引起。該疾病通常表現為急性或亞急性病癥，伴有高燒和持續廣泛的出血[1]、[2]、[3]。該病毒可感染所有品種和年齡段的家豬和野豬，具有高傳染性和致死性（95-100%）[1]、[4]、[5]。ASFV于1921年首次在肯尼亞被發現，此后在非洲、歐洲、東南亞和美洲引發了持續的疫情[6]。2018年8月，中國首次爆發疫情，隨后迅速蔓延至全國[7]。迄今為止，ASFV仍然是全球范圍內“導致豬死亡的主要殺手”[8]。世界動物衛生組織（WOAH）將ASF列為需報告的動物疾病[9]。2022年1月至2024年8月，共有61個國家和地區報告了ASF疫情，導致超過172.7萬頭豬死亡，嚴重影響了全球糧食安全和畜牧業[9]。然而，通過臨床癥狀或尸檢區分ASF和經典豬瘟（CSF）仍然具有挑戰性[10]。目前尚無針對ASFV的靶向治療方法或疫苗，因此早期檢測和撲殺是控制疫情的主要措施[11]。因此，開發一種簡單、快速、高度特異且靈敏的現場檢測方法對于ASFV的早期監測、疫情控制和減少豬群的發病率和死亡率至關重要。
ASFV是一種大型、二十面體、雙鏈DNA病毒（170-193 kbp），具有復雜的多層結構——包括外膜、衣殼、內膜、核心殼和核心——并編碼150-167個開放閱讀框（ORFs）[12]、[13]、[14]。B646L基因編碼主要的衣殼蛋白p72，在不同ASFV分離株中高度保守且具有亞型特異性[15]，因此被廣泛用作核酸檢測的目標。目前的ASFV檢測方法包括抗原/抗體檢測和核酸擴增。由于ASF通常表現為急性或亞急性病癥，且受感染的豬往往在血清轉化前死亡，基于病原體的診斷方法至關重要。根據WOAH指南，主要的病原體檢測技術包括病毒分離、血細胞吸附（HAD）檢測和核酸檢測[16]、[17]、[18]。病毒分離是金標準，但需要BSL-3級別的設施，無法用于快速或現場檢測[17]。HAD檢測具有高靈敏度和特異性，成本低，但依賴于原代細胞培養，且周轉時間較長[16]。傳統的PCR和實時定量PCR（qPCR）具有高靈敏度和特異性[18]，是中心實驗室的首選方法，但依賴于昂貴的儀器、試劑和熟練人員，不適合在農場、海關或市場進行現場檢測。
為了實現非洲豬瘟（ASF）的快速檢測，研究人員開發了等溫核酸擴增（INA）技術，包括環介導的等溫擴增（LAMP）[19]、重組酶聚合酶擴增（RPA）[20]、重組酶輔助擴增（RAA）[21]和交叉引物擴增（CPA）[22]。與傳統PCR相比，這些方法消除了對熱循環儀的需求并縮短了檢測時間。然而，它們受到非特異性擴增引起的假陽性、比PCR靈敏度低以及引物設計要求復雜等限制。
最近，由于CRISPR/Cas系統的卓越特異性，它們被用于核酸檢測[23]。這些檢測方法使用Cas9、Cas12、Cas13或Cas14核酸酶與引導RNA（gRNA）結合形成核糖核蛋白（RNP）復合物，這些復合物結合目標DNA或RNA序列并觸發Cas介導的順式切割[24]、[25]。同時，Cas核酸酶的旁路（反式）切割活性會降解附近的非目標核酸探針，從而增強檢測信號[24]。通過將等溫核酸擴增（INA）與CRISPR/Cas結合，研究人員實現了對寨卡病毒（ZIKV）、登革熱病毒（DENV）、人乳頭瘤病毒（HPV）和禽流感病毒（H7N9）等病原體的超靈敏檢測[26]、[27]、[28]。盡管這些組合方法消除了對復雜儀器的需求并提高了靈敏度和特異性，但仍需要勞動密集型的樣本裂解、純化和富集步驟。此外，擴增和檢測過程中的重復打開、試劑添加和移液步驟會增加氣溶膠的產生，帶來生物安全風險。為了克服這些限制，我們旨在開發一種超快速、無需提取且一鍋完成的集成平臺，用于現場檢測ASFV，以最小化污染風險。
在這項研究中，我們開發了一種新的檢測方法，稱為sCRAM（suboptimal protospacer adjacent motif (PAM)-mediated CRISPR RNA and Cas12a nuclease combined with multienzyme isothermal rapid amplification），作為一種可用于現場檢測ASFV的平臺。sCRAM檢測包括三個連續步驟：首先，使用快速等溫核酸釋放試劑處理臨床樣本，實現無需提取的樣本制備，從而簡化了分析前的工作流程；其次，通過工程化PAM寡核苷酸序列來減弱Cas12a的順式切割活性，組裝一個次優PAM介導的CRISPR RNA&Cas12a核糖核蛋白復合物，并將其與多酶重組酶介導的等溫擴增（MIRA）結合，實現一管式ASFV檢測；第三，在紫外光照射或側向流動條（LFS）下可視化擴增產物，允許肉眼解讀結果。在111個臨床樣本的測試中，整個sCRAM工作流程（包括樣本處理、核酸檢測和信號讀數）在20分鐘內完成。結果與qPCR完全一致，靈敏度為100%（20/20），特異性為100%（91/91）。sCRAM提供了一種快速、儀器需求少、可現場部署的平臺，是ASFV現場監測的有前景的技術，并且可以輕松適應其他病原體的即時核酸檢測。
材料
ASFV質粒由Sangon Biotech（中國上海）合成。HiScribe T7快速高產RNA合成試劑盒和RNase抑制劑購自New England Biolabs（中國北京）。DNA等溫快速擴增試劑盒購自Amp Future Biotech（中國常州）。LbaCas12a和側向流動條購自Tolo-Biotech（中國上海）。非洲豬瘟核酸檢測試劑盒來自SVDM Biotech（中國長沙）。2X M5 HiPer SYBR...
sCRAM的工作原理
sCRAM檢測方案（圖1）包括三個連續步驟：（1）使用快速釋放試劑進行無需核酸提取的樣本制備；（2）一管式整合次優PAM介導的CRISPR/Cas12a核酸酶與MIRA；（3）通過紫外光或側向流動條（LFS）進行結果可視化。為了評估其在現場條件下的適用性，測試了三種類型的臨床樣本（血液、血漿和拭子）。
討論
ASFV的全球傳播嚴重威脅了豬肉生產系統，危及了全球的糧食安全[32]。在缺乏許可疫苗或抗病毒療法的情況下，控制策略嚴重依賴于快速診斷和撲殺受感染的豬群[12]、[33]。然而，早期ASFV感染的表現是非特異性的臨床癥狀，與其他豬熱性疾病難以區分，而傳統的血清學檢測方法具有較長的診斷窗口期
結論
在這項研究中，我們開發了sCRAM，這是一種快速且可現場部署的ASFV檢測平臺，結合了次優PAM介導的CRISPR/Cas12a和多酶等溫擴增。該檢測方法在20分鐘內可實現單拷貝/微升的靈敏度，并且與主要豬病原體無交叉反應。通過對血液、血漿和拭子樣本的臨床驗證，使用紫外光讀數的符合率為100%，使用側向流動條的準確率為98.20%。
CRediT作者貢獻聲明
孫子龍：監督、方法論、概念設計。張丁：撰寫——初稿。牛瑞燕：正式分析、數據管理。聶友：撰寫——初稿、方法論、調查、正式分析。費思涵：驗證、資源管理、數據管理。李曉輝：撰寫——審稿與編輯、撰寫——初稿、正式分析、概念設計。雷琦：可視化、資源管理、項目協調。楊波：撰寫——初稿、軟件開發。文銀忠：
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文所述工作的競爭性財務利益或個人關系。
致謝
本研究得到了現代農業技術研究系統（編號：2025CYJSTX12-10）、山西省研究生實踐與創新項目（編號：2025SJ001）以及山西省科技創新團隊（編號：202304051001041）的專項資助。
李曉輝是山西農業大學獸醫學院的博士候選人（2024年），他的研究重點是動物疾病的診斷和治療。
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