霉菌毒素是有毒化合物，對人類健康有害，由真菌物種作為次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生[[1], [2], [3]]。在已知的霉菌毒素中，黃曲霉毒素是最有害和致癌的，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其列為I類致癌物[4,5]。目前已發(fā)現(xiàn)并鑒定出20多種黃曲霉毒素亞型，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）對人類危害最大[6]。食品中的AFB1不僅會造成身體傷害，還會導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失[7]。為保證食品安全，許多國家和組織制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)管措施來限制AFB1的含量[8]。因此，開發(fā)靈敏高效的AFB1檢測技術(shù)至關(guān)重要[9]。目前，AFB1的常用檢測方法主要包括色譜技術(shù)和ELISA[10,11]。基于色譜的方法在AFB1檢測中顯示出高可靠性和靈敏度，但通常存在某些局限性（例如，檢測設(shè)備昂貴、需要專業(yè)操作人員以及復(fù)雜的樣品預(yù)處理程序[12,13]。ELISA檢測AFB1也有一定局限性，如成本高和單克隆抗體制備復(fù)雜[10]。因此，迫切需要開發(fā)新型檢測技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)便攜、快速和低成本的AFB1檢測。
CRISPR及其相關(guān)蛋白（CRISPR/Cas）（例如CRISPR/Cas12a）作為一種新興的強(qiáng)大基因編輯工具，已廣泛應(yīng)用于生物傳感器的設(shè)計(jì)和開發(fā)[14,15]。在程序化CRISPR RNA（crRNA）的引導(dǎo)下，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)可以精確識別含有PAM位點(diǎn)的目標(biāo)DNA，啟動Cas12a蛋白的切割活性[16,17]。由于其高選擇性、crRNA易于生產(chǎn)以及能夠精確靶向和切割核酸的能力，基于CRISPR/Cas的生物傳感平臺已應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，包括分子診斷和核酸檢測（例如病原體[18,19]。最近，基于CRISPR/Cas的生物傳感平臺也被用于非核酸目標(biāo)的檢測[[20], [21], [22], [23], [24], [25]]。例如，Xiang等人基于CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)策略，開發(fā)了一種新型的功能性DNA引導(dǎo)的過渡態(tài)CRISPR/Cas12a微流控生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和高通量的霉菌毒素檢測[24]。Ma等人通過探索適配體對AFB1的識別機(jī)制，合理建立了CRISPR/Ca12a與Exo III耦合的AFB1檢測平臺[25]。為了實(shí)現(xiàn)高靈敏度，大多數(shù)基于CRISPR/Cas的核酸檢測方法需要對目標(biāo)進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增[26]。由于等溫?cái)U(kuò)增具有快速、簡單和高效的信號放大優(yōu)勢，通常將其與CRISPR/Cas檢測方法結(jié)合使用以提高檢測靈敏度[27,28]。鏈置換擴(kuò)增（SDA）被認(rèn)為是一種高效的線性擴(kuò)增方法，其擴(kuò)增產(chǎn)物可以觸發(fā)指數(shù)級擴(kuò)增反應(yīng)（EXPAR）。基于SDA和EXPAR的級聯(lián)擴(kuò)增可以彌補(bǔ)單次擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度和特異性不足[4]。因此，這種多重等溫?cái)U(kuò)增方法對于提高CRISPR/Cas檢測方法的靈敏度非常有前景。
此外，高效的信號探針對于提高基于CRISPR/Cas的檢測方法的靈敏度非常重要[29]。目前，大多數(shù)基于CRISPR/Cas的熒光檢測方法使用熒光團(tuán)和淬滅劑雙標(biāo)記的熒光探針來產(chǎn)生檢測信號[30]。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）在核酸酶消化過程中發(fā)光，恢復(fù)的熒光反映了目標(biāo)的豐度[31]。盡管FRET易于測量且操作簡單，但需要在兩端進(jìn)行雙重標(biāo)記，這使得制造過程繁瑣且成本較高[30]。此外，F(xiàn)Q探針通常具有較高的背景信號和較差的光穩(wěn)定性[32]。因此，為了提高CRISPR/Cas檢測系統(tǒng)的靈敏度和可靠性，仍需開發(fā)廉價(jià)可靠的熒光納米探針。一種獨(dú)特的極小熒光納米材料是貴金屬納米簇[33]。這些貴金屬納米簇具有許多優(yōu)點(diǎn)（例如，大表面積、優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)和高摩爾吸附率），并且已經(jīng)設(shè)計(jì)了多種類型的生物分子作為其合成模板（如肽、蛋白質(zhì)和核酸[34,35]。其中，DNA寡核苷酸作為引導(dǎo)金屬納米簇成核的理想支架，因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)（例如，相對簡單的構(gòu)象、特定的分子識別性質(zhì)和可調(diào)的序列結(jié)構(gòu)）而受到特別關(guān)注[36,37]。基于DNA的金屬納米簇由于其優(yōu)勢（例如，高亮度、光穩(wěn)定性、良好的生物相容性和易于合成以及發(fā)射顏色的調(diào)節(jié)）成為DNA生物分析的強(qiáng)大探針[36,37]。因此，已經(jīng)開發(fā)了多種不同的DNA模板金屬納米簇，包括鉑納米簇、銅納米簇、金納米簇和合金納米簇[36]。近年來，熒光銅納米顆粒因其優(yōu)勢（例如，低成本、優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)和簡單的合成方法）而受到廣泛研究[38]。此外，CuO作為一種具有優(yōu)異物理化學(xué)性質(zhì)的穩(wěn)定材料[39,40]。特別是DNA模板銅納米簇（DNA-CuNCs）因其獨(dú)特的優(yōu)勢（例如，低成本、幾分鐘內(nèi)快速合成、出色的光學(xué)特性和較大的斯托克斯位移[41,42]）而備受關(guān)注。所有這些優(yōu)點(diǎn)使DNA-CuNCs成為分析檢測領(lǐng)域中出色的金屬納米熒光探針，為構(gòu)建高靈敏度的納米生物傳感系統(tǒng)提供了有希望的策略。例如，Wu等人使用富含腺嘌呤胸腺嘧啶（AT）的單鏈DNA（ssDNA）作為模板成功合成了熒光CuNCs[43]。此外，Zhang等人使用抗壞血酸作為還原劑和富含AT的互補(bǔ)雙鏈莖作為模板合成了熒光CuNCs[44]。因此，熒光DNA-CuNCs在構(gòu)建基于CRISPR/Cas12a的熒光生物傳感平臺方面顯示出巨大潛力。
在這項(xiàng)工作中，基于發(fā)光的DNA-CuNCs和多重等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)，開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12a的無標(biāo)記熒光生物傳感平臺，用于超靈敏的AFB1檢測。如圖1所示，當(dāng)AFB1存在時(shí)，適配體-cDNA復(fù)合物從磁珠（MB）上釋放出cDNA（P），啟動隨后的SDA/EXPAR過程。釋放的P序列可以與模板鏈（P′-Q′序列）結(jié)合，并在內(nèi)切酶和DNA聚合酶的催化下進(jìn)行SDA擴(kuò)增，得到Q序列。然后，Q序列進(jìn)行EXPAR擴(kuò)增并與其他模板鏈（Q′-Q′序列）結(jié)合，生成大量Q序列。擴(kuò)增產(chǎn)物（Q序列）觸發(fā)了CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的切割活性，降解ss-DNA鏈并抑制DNA-CuNCs的形成，從而發(fā)出最小的熒光。本研究中合成的DNA-CuNCs用于構(gòu)建Cas12a介導(dǎo)的熒光生物傳感器，使其具有高靈敏度。此外，DNA-CuNCs可以從無標(biāo)記DNA單鏈合成，并且可以在5分鐘內(nèi)快速合成，無需復(fù)雜的設(shè)備或苛刻的反應(yīng)條件。通過將多重等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與基于發(fā)光DNA-CuNCs的熒光生物傳感器結(jié)合，所建立的方法有望實(shí)現(xiàn)簡單、快速且無需標(biāo)記的AFB1檢測。
