《Metabolic Engineering》：Predictive CRISPR-mediated gene downregulation for enhanced production of sustainable aviation fuel precursor in
Pseudomonas putida
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本研究針對CRISPRi技術在代謝工程中面臨的兩個關鍵挑戰：有效基因靶點的理性識別和多路CRISPRi系統的高效構建。研究人員開發了計算優先工具FluxRETAP與模塊化組裝方法VAMMPIRE相結合的新策略，用于增強惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)中可持續航空燃料前體異戊二烯醇(isoprenol)的生產。結果表明，FluxRETAP預測的基因敲除靶點中有46.4%顯著提高了異戊二烯醇產量，最高滴度達1.5 g/L，顯著優于傳統直覺式靶點選擇方法(15.7%)。VAMMPIRE實現了最多包含五個sgRNA陣列的CRISPRi構建體的精確組裝，減少了上下文依賴性，實現了均勻、位置獨立的基因下調。該研究為微生物代謝工程提供了一種高效、可預測的菌株優化新范式。
隨著生物技術產業的快速發展，利用微生物細胞工廠生產高價值化學品已成為可持續制造的重要方向。其中，異戊二烯醇(isoprenol)作為一種高度通用的分子，在醫藥、化妝品和工業化學品等領域具有廣泛應用，特別是作為噴氣燃料1,4-二甲基環辛烷(DMCO)的前體，在可持續航空燃料領域展現出巨大潛力。然而，異戊二烯醇的生物合成效率常常受到宿主生物代謝通路效率和高產量生產能力的限制。
近年來，CRISPR干擾(CRISPRi)技術作為一種強大的基因調控工具，通過使用失活的Cas9(dCas9)蛋白實現基因表達的抑制，而無需對基因組進行永久性修飾，為代謝工程提供了新的可能性。盡管如此，CRISPRi技術的廣泛應用仍面臨兩大挑戰：一是如何理性識別有效的基因下調靶點，二是如何高效構建多路CRISPRi系統。傳統的靶點選擇方法主要依賴直覺式推理和試錯策略，耗時耗力且效率有限；而現有的計算方法如最小切割集(cMCS)往往假設基因相互作用是簡單的二元開關邏輯，難以捕捉生物網絡中復雜的表達梯度、反饋環和非線性相互作用。同時，多基因敲除的實現受到分子克隆方法的嚴重限制，CRISPRi陣列在克隆過程中容易因重復DNA序列而發生同源重組事件。
為了解決這些挑戰，來自美國聯合生物能源研究所(JBEI)的Ian S. Yunus、Taek Soon Lee等研究人員在《Metabolic Engineering》上發表了一項創新性研究，他們整合了一種計算優先工具FluxRETAP(通量-反應靶點優先排序)與一種多功能組裝方法VAMMPIRE(多路CRISPRi介導下調的多功能組裝方法)，系統性地提高了惡臭假單胞菌KT2440中異戊二烯醇的產量。
研究人員首先應用FluxRETAP算法，這是一種基于基因組尺度模型的簡單且計算成本較低的方法，利用通量變異性分析(FVA)和反應通量的高斯分布來優先考慮上調或下調的基因。該算法通過確定基因組尺度代謝模型中最終產物反應的最大理論產量(MTY)，模擬不同生產水平(如MTY的10%至100%)，通過FVA找到與每個水平兼容的通量值，并用高斯分布表示這些通量值。通過計算低生產水平(如10%、20%)和高生產水平(如90%、100%)分布之間的重疊區域，重疊較小的反應(表明低和高生產水平之間通量差異大)獲得較高分數，成為基因下調的主要候選者。
與此同時，研究團隊開發了VAMMPIRE方法，這是一種基于連接子的模塊化克隆組裝方法，專門用于簡化sgRNA陣列的組裝。該方法通過兩個簡化步驟實現：首先將sgRNA寡核苷酸酶切并連接至sgRNA儲存質粒，然后使用基于連接子的模塊化克隆方法將sgRNA(s)酶切并連接至CRISPRi質粒。該方法采用組成型J23119啟動子控制每個sgRNA的轉錄，并使用在惡臭假單胞菌KT2440中有功能但在大腸桿菌中無活性的PnagAa啟動子驅動dCas9表達，從而最大限度地減少克隆過程中dCas9的表達負擔。
關鍵技術方法
本研究主要采用了幾項關鍵技術：1) FluxRETAP計算平臺，基于基因組尺度代謝模型和通量變異性分析預測基因下調靶點；2) VAMMPIRE組裝方法，用于構建多路CRISPRi-sgRNA質粒；3) CRISPRi基因下調技術，在惡臭假單胞菌KT2440中實現特異性基因表達抑制；4) 蛋白質組學分析，通過液相色譜-質譜聯用技術評估基因下調效率；5) 代謝物分析，監測TCA循環關鍵中間產物濃度變化。研究使用的惡臭假單胞菌KT2440菌株來自實驗室保藏菌種。
3.1. 識別用于提高異戊二烯醇產量的CRISPRi下調靶基因
研究人員選擇了一個經過高度工程化、具有高基線滴度的異戊二烯醇生產惡臭假單胞菌KT2440菌株作為全基因組篩選的平臺。基于異戊二烯醇生物合成途徑中乙酰輔酶A、NADPH和ATP的關鍵作用，他們首先直覺性地選擇了51個參與乙酰輔酶A、輔因子和能量代謝的基因作為下調靶點。與此同時，應用FluxRETAP識別了57個基因作為下調靶點，這些基因主要涉及氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、碳水化合物代謝、ABC轉運代謝、能量代謝、核苷酸代謝和脂質代謝等途徑。FluxRETAP根據重疊面積的倒數值對這些基因進行排名，為后續實驗驗證提供了優先順序。
3.2. VAMMPIRE：多路CRISPRi介導下調的多功能組裝方法
VAMMPIRE方法的開發極大地簡化了多路sgRNA質粒的構建過程。研究人員通過該方法成功構建了275個CRISPRi質粒，包括197個攜帶單個sgRNA的質粒、41個攜帶兩個sgRNA的質粒、24個攜帶三個sgRNA的質粒、11個攜帶四個sgRNA的質粒和兩個攜帶五個sgRNA的質粒。所有質粒均通過一鍋法組裝完成，PCR和Sanger測序驗證顯示100%的組裝準確性。功能驗證實驗表明，CRISPRi系統在惡臭假單胞菌KT2440中能有效下調紅色熒光蛋白(RFP)和必需基因accA(編碼乙酰輔酶A羧化酶羧基轉移酶亞基α)的表達。蛋白質組學分析進一步證實，125個攜帶不同sgRNA的樣本中，68個基因被下調至少50%，其中51個基因被下調超過95%，證明了CRISPRi在該宿主中的可靠性。
特別值得注意的是，研究人員系統評估了sgRNA在多重陣列中的位置效應。與傳統的多順反子設計不同，VAMMPIRE構建的陣列由獨立轉錄的sgRNA組成，每個sgRNA在相同的調控控制下。實驗結果表明，無論sgRNA在陣列中的位置如何，基因抑制水平都保持一致，表明該方法有效減少了位置依賴性，為代謝工程中的可預測基因調控提供了重要優勢。
3.3. 預測性CRISPRi下調改善異戊二烯醇生產
為了比較FluxRETAP和直覺式基因選擇在提高異戊二烯醇產量方面的效果，研究人員將CRISPRi質粒轉化到高產異戊二烯醇菌株(IY1452)中。結果顯示，FluxRETAP推薦的基因下調菌株的平均異戊二烯醇滴度顯著高于對照組，且顯著高于直覺式方法獲得的滴度。具體而言，FluxRETAP鑒定的56個基因中，46.4%的基因下調導致異戊二烯醇滴度顯著高于對照菌株，而直覺式靶基因選擇僅有15.7%的基因表現出更高的滴度。最高的異戊二烯醇滴度達到1469 mg/L，是通過下調FluxRETAP鑒定的PP_4188(編碼α-酮戊二酸脫氫酶)實現的，而直覺式組的最高滴度僅為958 mg/L，來自PP_0168下調菌株。這些結果充分證明了FluxRETAP在識別能改善生物生產性能的下調靶點方面的有效性。
3.4. PP_4188下調的代謝和蛋白質組學洞察
對高產菌株PP_4188的深入分析揭示了其高產機制。蛋白質組學分析表明PP_4188被下調了75%，導致細胞內α-酮戊二酸積累增加。進一步的蛋白質組學分析發現，PP_4188下調引起了廣泛的蛋白質組變化：約145個基因被下調，193個基因被上調。其中，轉谷氨酰胺酶樣超家族結構域蛋白(PP_2686)的表達增加了450倍以上。Pearson相關分析顯示，PP_2686的上調與高異戊二烯醇滴度呈正相關(相關系數=0.4593，p值=3×10-8)，表明這一現象不是孤立事件。研究人員推測，谷氨酸在異戊二烯醇代謝中扮演重要角色，這與先前觀察到的谷氨酸補充能減少惡臭假單胞菌中異戊二烯醇分解代謝的結果一致。
研究人員還嘗試通過多基因下調進一步優化產量，將PP_4188與之前鑒定的有潛力的靶點配對進行多重CRISPRi下調。然而，沒有一種工程菌株的異戊二烯醇滴度超過單獨下調PP_4188的菌株。進一步分析發現，PP_4188單一下調菌株中核糖體亞基編碼基因的表達水平降低，這可能觸發了細胞應激反應或將資源從核糖體生物合成轉移出去。由于核糖體生物合成對蛋白質合成和細胞生長至關重要，其下調可能限制細胞支持額外代謝負擔的能力，從而解釋了多重基因下調未能進一步提高產量的原因。
研究結論與意義
本研究通過整合預測性建模與模塊化CRISPRi工具，成功開發了一種提高惡臭假單胞菌中異戊二烯醇產量的綜合策略。FluxRETAP有效優先考慮了能增強異戊二烯醇生產的基因敲除靶點，而VAMMPIRE則實現了CRISPRi構建體的簡便、準確且位置獨立的組裝。觀察到的guide RNA位置對基因抑制影響極小這一發現，擴展了CRISPRi陣列在多路應用中的實用性。
該研究的創新性體現在多個方面：首先，FluxRETAP計算方法的成功應用證明計算引導的基因選擇能顯著提高代謝工程效率，發現的非直觀基因靶點對產品產量有重大影響；其次，VAMMPIRE方法解決了多路基因下調構建中的關鍵技術瓶頸，為合成生物學提供了強大工具；再者，對sgRNA位置效應的系統評估為CRISPRi技術的可靠應用提供了重要見解。
盡管在多重基因下調方面遇到挑戰，但本研究揭示的代謝復雜性為未來優化策略指明了方向。例如，精細調控PP_4188的下調水平可能有助于優化代謝通量，減少對核糖體生物合成和細胞適應性的意外干擾，使得實施多個精心校準的基因下調成為可能。
總之，這項研究展示了一種將計算預測與實驗驗證相結合的系統性方法，為微生物代謝工程提供了新范式。預測性建模與位置穩健的基因敲除相結合，為更高效的設計-構建-測試-學習(DBTL)循環和理性設計高性能微生物細胞工廠鋪平了道路，對可持續生物制造和綠色生物經濟發展具有重要意義。
