《Metabolic Engineering》：Biosynthetic platform for orsellinic acid-derived meroterpenoids in
Escherichia coli
編輯推薦：
本研究針對苔色酸(OSA)來源的聚酮-萜類化合物植物提取效率低、供應不穩定的問題，通過在大腸桿菌中構建從頭生物合成平臺，結合CRISPRi基因敲降、代謝工程及培養條件優化，將OSA產量提升至202 mg/L，并首次實現grifolic acid (GFA)的微生物合成，為藥理活性分子的可持續生產提供了新策略。
在天然產物藥物開發領域，苔色酸(Orsellinic Acid, OSA)來源的聚酮-萜類化合物(Meroterpenoids)因其廣泛的藥理活性（如抗癌、抗HIV、抗糖尿病和抗炎等）而備受關注。然而，這類化合物目前主要從杜鵑花屬植物中直接提取，其生產嚴重受限于植物生長周期長、環境依賴性高、提取工藝復雜以及野生資源保護等問題。更棘手的是，現有微生物發酵法生產OSA的效率極低（最高僅約5 mg/L），嚴重阻礙了其衍生藥物的規模化開發。因此，開發高效、可持續的微生物合成平臺迫在眉睫。
為突破這一瓶頸，日本神戶大學的研究團隊在《Metabolic Engineering》上發表論文，報道了在大腸桿菌(Escherichia coli)中成功構建的OSA及其衍生聚酮-萜類化合物的從頭生物合成平臺。研究人員首先通過系統篩選，發現植物來源的III型聚酮合酶(PKS) ORS與其環化酶OAC的共表達，能在大腸桿菌中實現OSA的微量合成（1.4 mg/L）。隨后，他們利用CRISPR干擾(CRISPRi)技術對競爭代謝路徑進行精準調控，發現敲降脂肪酸代謝調控因子fadR基因可顯著提升OSA產量（提高約7.9倍）。代謝組學分析進一步揭示，丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)的供應不足是限制OSA合成的關鍵瓶頸。基于這一發現，研究團隊通過過表達乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、泛酸激酶(CoaA)和ATP檸檬酸裂解酶(ACL)，協同強化乙酰輔酶A(acetyl-CoA)和malonyl-CoA的供應，使OSA產量大幅提升至78.6 mg/L。最后，通過優化培養條件（TB培養基、0.2 mM IPTG誘導、20°C培養），OSA產量最終達到202 mg/L，較初始水平提高145倍，并首次在該平臺中實現代表性聚酮-萜類化合物grifolic acid (GFA)的從頭合成（產量2.5 μg/g-DCW）。
本研究采用的關鍵技術方法包括：基因工程菌株構建（引入異源PKS及環化酶基因）、CRISPRi介導的基因表達調控、代謝組學分析（監測中心代謝物動態變化）、實時定量PCR驗證基因敲降效率，以及高效色譜-質譜聯用技術（GC-MS/LC-MS/MS）定量目標產物。
3.1. OSA production in E. coli
通過比較多種I型與III型PKS在大腸桿菌中的表達效果，發現僅當共表達植物來源的ORS與OAC基因，并在25°C低溫培養時，才能檢測到OSA合成（1.4 mg/L），證明III型PKS更適合在大腸桿菌中表達，且低溫有助于酶的正確折疊。
3.2. CRISPR interference for enhancing OSA production via gene expression repression
利用CRISPRi分別敲降poxB-pta（乙酸合成路徑）、pabA（芳香族氨基酸合成）和fadR（脂肪酸代謝調控因子），發現fadR敲降對OSA產量提升最為顯著（15.1 mg/L），說明抑制脂肪酸合成可有效將malonyl-CoA導向OSA合成路徑。
3.3. Rate-limiting step identification using metabolome analysis
代謝組學分析顯示，工程菌株中malonyl-CoA濃度極低（<0.03 nmol/mg-DCW），且其在誘導后24小時內幾乎耗盡，而acetyl-CoA和檸檬酸儲量豐富，明確malonyl-CoA供應是限速步驟。
3.4. Metabolic engineering based on metabolome analysis
通過組合過表達ACC（催化acetyl-CoA向malonyl-CoA轉化）、CoaA（增強輔酶A供應）和ACL（利用檸檬酸再生acetyl-CoA），實現acetyl-CoA和malonyl-CoA供應的協同強化，使OSA產量提升至78.6 mg/L。
3.5. Culture condition optimization
系統優化培養基（TB優于2×YT）、碳源（葡萄糖優于甘油）、IPTG濃度（0.2 mM最佳）和培養溫度（20°C時單位細胞產量最高），最終在72小時使OSA產量達到202 mg/L，產量為6.1 mg/g-glucose。
3.6. GFA production by optimized OSA high-producing strains
在高效合成OSA的菌株中引入植物來源的異戊烯基轉移酶RdPT1，成功實現GFA的細胞內合成（2.5 μg/g-DCW），首次在大腸桿菌中完成OSA來源聚酮-萜類化合物的從頭生物合成。
4. Discussion
本研究通過多維度代謝工程策略，將大腸桿菌轉化為OSA及其衍生物的高效合成平臺。fadR敲降與ACC/CoaA/ACL過表達的協同作用，有效解決了malonyl-CoA供應瓶頸；低溫培養優化了III型PKS的活性。盡管GFA產量仍較低（受限于FPP供應和異源酶活性），該平臺為其他OSA衍生藥物（如daurichromenic acid等）的微生物法生產奠定了基礎。未來可通過優化甲羥戊酸路徑增強FPP供應、開發細菌兼容性異戊烯基轉移酶，并結合實驗設計(DoE)進一步優化培養條件，有望實現OSA來源藥物的產業化應用。
