堿基編輯器（Base editors），如腺嘌呤堿基編輯器（ABEs）和胞嘧啶堿基編輯器（CBEs），能夠在不引起DNA雙鏈斷裂（DSBs）的情況下精確安裝單堿基改變，在治療遺傳疾病方面潛力巨大。然而，與其它基因編輯器一樣，堿基編輯器也可能在具有序列同源性的脫靶基因組位點產生非預期修飾，因此需要靈敏且無偏的方法來評估其安全性。現有方法，如Digenome-seq和EndoV-seq，依賴于對體外堿基編輯器處理的gDNA進行全基因組測序（WGS），需要數億測序讀長，靈敏度低、成本高且可擴展性差。而ONE-seq等方法則依賴于計算預選候選脫靶位點，存在偏倚。

為此，研究人員開發了CHANGE-seq-BE方法。該方法基于此前為Cas9核酸酶開發的CHANGE-seq方法進行優化，旨在實現對堿基編輯器修飾的gDNA進行選擇性測序。其工作流程包括：純化的gDNA通過含有環化接頭DNA的定制Tn5轉座酶進行標簽化（tagmentation）；標簽化gDNA通過分子內連接環化；殘余線性DNA被核酸外切酶混合物降解，獲得高純度的gDNA環；環化gDNA在體外與ABE或CBE核糖核蛋白（RNP）復合物孵育，在脫靶位點切割目標DNA鏈并將非目標鏈上的腺嘌呤脫氨為次黃嘌呤（inosine, ABE）或胞嘧啶脫氨為尿嘧啶（uracil, CBE）；對于ABE，含有切口和次黃嘌呤的gDNA環隨后被內切核酸酶V（endonuclease V）處理，該酶切割次黃嘌呤相鄰的DNA；對于CBE，含有尿嘧啶的DNA環被USER酶（一種尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂合酶內切核酸酶VIII的混合物）處理，切除尿嘧啶堿基，產生具有5′突出端的線性DNA；最后，這些線性DNA分子經過末端修復、連接測序接頭并擴增，用于選擇性高通量測序。

經過系統的流程優化（包括環化gDNA的核酸外切酶處理、堿基編輯反應條件和末端修復方案），CHANGE-seq-BE能夠一致地檢測到所有先前驗證過的ABE8e-NRCH:HBB^S-gRNA的54個脫靶位點。對于ABE，CHANGE-seq-BE讀長捕獲了體外堿基編輯的獨特分子特征，即次黃嘌呤堿基在PCR擴增后轉化為鳥嘌呤（G），表現為A-to-G的脫氨頻率，在提名的主要脫靶位點中觀察到25%至48%的脫氨頻率。該方法也適用于CBEs（如eA3A-BE3），盡管C-to-T的堿基轉換在CHANGE-seq-BE讀長中不可檢測，但斷裂點位置仍然清晰。

對ABE8e-NRCH靶向HBB^S的CHANGE-seq-BE實驗顯示，技術重復間的讀長計數高度相關（Pearson相關系數r = 0.9814），脫靶活性位點廣泛分布于整個基因組。與使用同源Cas9核酸酶的CIRCLE-seq方法相比，CHANGE-seq-BE和CIRCLE-seq的讀長計數僅弱相關（r = 0.34），且兩種方法檢測到的脫靶位點只有40%重疊，表明ABE8e的全基因組脫靶活性在數量上不同于Cas9核酸酶。

為了確認CHANGE-seq-BE獨家檢測到的新脫靶位點是否在細胞中是真實存在的，研究人員對之前研究中使用過的、經ABE8e-NRCH mRNA處理的CD34⁺造血干祖細胞（HSPCs）的相同gDNA，對131個僅由CHANGE-seq-BE檢測到的位點進行了多重靶向測序。結果發現，CHANGE-seq-BE不僅識別了全部54個已知的細胞脫靶位點，還額外發現了29個先前未知的真實脫靶位點，比最初使用CIRCLE-seq的篩選多出53%，其ABE活性范圍在0.55%至13.9%之間。對于HBB^S-gRNA的真實脫靶位點，CHANGE-seq-BE的富集比顯著高于CIRCLE-seq，平均高出2.1倍。這些脫靶活性主要發生在基因間區和內含子區，有6個脫靶位點位于外顯子區。

為了系統評估ABEs和CBEs在體外的全基因組脫靶活性，研究人員在人類原代T細胞（靶點：B2M, CBLB, CD7, CIITA, PDCD1）和人類原代肝細胞（靶點：PCSK9）上進行了CHANGE-seq-BE。對于這六個gRNA靶點，CHANGE-seq-BE在兩個實驗重復中提名了總共4,199個靶向和脫靶位點（范圍從236到1,604個）。

為了比較CHANGE-seq-BE與另一種領先的脫靶發現方法Digenome-seq的靈敏度，研究人員對相同的gRNA靶點進行了Digenome-seq。Digenome-seq共識別出796個靶向和脫靶位點（范圍從36到162個）。隨后，通過雜交捕獲測序（hybrid capture sequencing）全面評估了4,291個由任一方提名且成功捕獲和擴增的位點，在其中96個位點檢測到顯著的脫靶改變，細胞活性范圍從0.44%到93.1%。在83個（共96個）T細胞真實脫靶位點中，33.3%至100%的位點被兩種方法共同識別，6.9%至16.7%的位點僅由Digenome-seq識別，而29.3%至55.6%的位點僅由CHANGE-seq-BE獨家識別。對提名和真實脫靶位點的基因組位置注釋分析顯示，兩者均主要分布在基因間區和內含子區。與CHANGE-seq-BE提名的脫靶位點（10.3%）相比，真實細胞脫靶位點（17.7%）在轉錄區域顯著富集。

同樣，對CBE（eA3A-BE3）靶向B2M, CBLB, CD7, CIITA, PDCD1的研究中，CHANGE-seq-BE提名了總共850個位點，而Digenome-seq僅提名了25個位點。雜交捕獲測序驗證顯示，兩種方法都檢測到所有靶點的高頻靶向編輯（52.3%至97.6%）以及CIITA的一個高頻脫靶位點（編輯率17%）。然而，許多編輯率在1.7%至7.5%的低頻脫靶位點僅被CHANGE-seq-BE發現，而未被Digenome-seq識別。

總之，CHANGE-seq-BE比Digenome-seq更靈敏，同時所需測序讀長減少20倍。CHANGE-seq-BE是堿基編輯器細胞脫靶活性的強預測指標，可用于常規和治療應用中候選靶點的選擇。

與人類基因編輯產品相關的安全風險包括非預期的脫靶和靶向活性及其長期后果。一個不太明顯但關鍵的問題是，關鍵基因組編輯組件（如gRNA）的污染可能導致基因編輯指向非預期的靶向位點。

在最初使用研究級、化學合成并經高效液相色譜（HPLC）純化的gRNA進行CHANGE-seq-BE實驗試點時，研究人員在堿基編輯器處理的樣本中觀察到跨多個靶點的CHANGE-seq-BE讀長計數，而在未處理的對照中則沒有，這提示了存在污染的合成gRNA活性。例如，在用CBLBgRNA靶點處理的gDNA樣本中，檢測到PDCD1, CD7和CIITA靶點處強烈的非預期活性。據制造商討論，這種交叉污染最可能的來源是在同一HPLC柱上順序純化這些gRNA。在第二批來自同一制造商的gRNA中，通過采用更嚴格的柱清洗程序，可檢測的交叉污染活性得到了緩解。

為了識別和測量污染gRNA的頻率，研究人員使用了一種基于成熟小RNA測序技術的gRNA測序方法。評估了來自三家合成gRNA制造商（A, B, C）的五條研究級gRNA序列中是否存在gRNA污染物。在供應商A（批次1）的CBLB和CIITAgRNA中檢測到污染gRNA的存在，頻率范圍在0.09%至2.71%。

為了確定在體外通過CHANGE-seq-BE活性和gRNA測序檢測到的相對微量的gRNA污染物是否在細胞中具有活性，研究人員對用供應商A生產的靶向CBLB和CIITA位點的ABE8e編輯的原代人類T細胞的gDNA進行了靶向測序。對于旨在進行CBLB編輯的細胞，額外評估了PDCD1和CIITA靶向位點的編輯；對于旨在進行CIITA編輯的細胞，額外評估了PDCD1和CD7靶向位點的編輯。在所有與污染gRNA相關的非預期靶向位點均檢測到與腺嘌呤堿基編輯一致的點突變，活性范圍在0.83%至5.24%。

這一發現凸顯了使用靈敏、無偏的全基因組方法進行堿基編輯器脫靶發現的另一個優勢：識別污染gRNA的非預期“靶向”活性。當使用相同的色譜設備純化多個化學合成gRNA時，這可能是一個普遍存在的問題，特別是在治療應用中，需要謹慎以最小化gRNA合成污染風險。

為了評估堿基編輯器（ABE8e）和核酸酶（Cas9）之間的生化活性差異，研究人員還在人類原代T細胞的相同五條gRNA（B2M, CBLB, CD7, CIITA, PDCD1）上進行了CHANGE-seq（使用Cas9核酸酶）。CHANGE-seq為所有五個靶點檢測到總共7,430個靶向和脫靶位點（而CHANGE-seq-BE為3,734個位點）。實驗重復間的讀長計數在CHANGE-seq（r > 0.86）和CHANGE-seq-BE（r > 0.96）中均高度相關。然而，在不同方法之間，CHANGE-seq和CHANGE-seq-BE的讀長計數相關性較低，且隨gRNA靶點不同而變化（r = 0.2–0.73）。這表明ABE8e堿基編輯器和Cas9的生化活性都具有高度可重復性且彼此不同。

為了直接評估Cas9核酸酶和ABEs在細胞脫靶活性方面的差異，研究人員用Cas9 mRNA編輯了所有五個靶點的T細胞，并對總共2,226個脫靶位點（包括1,436個僅由Cas9 CHANGE-seq提名的脫靶位點）進行了雜交捕獲靶向測序。所有五個靶點均實現了ABE8e（96.5–99.4% A-to-G堿基編輯）和Cas9（70.7–92% 插入缺失）的高頻靶向編輯。對于ABE8e，在所有五個靶點共識別出83個T細胞真實脫靶位點，堿基編輯頻率范圍從0.44%到93.1%。相比之下，對于Cas9，僅確認了一個真實脫靶位點（靶向PDCD1），平均插入缺失為2.4%。

為了獨立驗證雜交捕獲測序測量的編輯活性，研究人員對所有五個靶點進行了GUIDE-seq-2（使用mRNA遞送Cas9）。在匹配的遞送條件下，觀察到的GUIDE-seq-2脫靶活性譜與雜交捕獲靶向測序結果一致，只有PDCD1的OT01明顯高于GUIDE-seq-2的檢測下限。使用Cas9 RNP進行的GUIDE-seq-2產生了稍多但仍相當低的脫靶活性，范圍在0.01%至3.4%。

總體而言，堿基編輯器在與同源核酸酶直接比較時具有不同的脫靶編輯譜。例如，在受控遞送條件下對Cas9和ABE8e的比較表明，ABE8e比Cas9具有顯著增加的脫靶活性，98.8%的已驗證脫靶位點為ABE8e所獨有。因此，必須使用直接方法來評估堿基編輯器的脫靶活性，而不能僅僅依賴基于核酸酶的方法。

研究人員應用CHANGE-seq-BE的靈敏脫靶檢測能力，定量表征了一種ABE堿基編輯策略的全基因組gRNA依賴性脫靶譜，該策略旨在通過糾正CD40L突變（c.658C>T; p.Q220X）來治療一名X連鎖高IgM綜合征（X-HIGM）患者。使用CHANGE-seq-BE，研究人員在整個人類基因組中識別出總共81個潛在脫靶位點，且兩個技術重復間的實驗相關性良好。這些脫靶位點大多數發生在內含子和基因間區，有兩個位于外顯子區。通過使用rhAmpSeq進行多重靶向測序驗證，觀察到95.4%的靶向編輯，與對照組相比，未檢測到高于閾限值的脫靶效應。這成功支持了一項針對CD40LHIGM綜合征患者的緊急個性化堿基編輯器造血干細胞和T細胞治療的緊急研究性新藥（IND）申請（臨床試驗編號NCT06959771），證明了CHANGE-seq-BE在支持IND申請方面的作用。

本研究描述的CHANGE-seq-BE方法，為全面分析堿基編輯器全基因組活性提供了一種同時具備高靈敏度和無偏性的途徑。該方法結合了理想特性，可在單一方案內直接識別gRNA依賴性堿基編輯器脫靶效應，并良好適用于ABEs和CBEs。

該方法也存在一些局限性。首先，CHANGE-seq-BE文庫目前需要比核酸酶的CHANGE-seq文庫更高的測序深度才能達到相當的靶向讀長計數。其次，與其他生化方法一樣，其表觀驗證率較低。第三，所有表征編輯器全基因組活性的生化方法的一個內在局限性是需要純化的蛋白質。最后，CHANGE-seq-BE并非設計用于檢測gRNA非依賴性脫靶效應。

CHANGE-seq-BE相較于現有方法在靈敏度和測序效率方面具有關鍵優勢。與依賴堿基編輯器修飾gDNA的WGS的生化方法（如Digenome-seq）相比，CHANGE-seq-BE觀察到的背景讀長率顯著降低，使其在測序效率提高約20倍的同時實現了更高的靈敏度。相對高效的測序需求（每個樣本約2500萬讀長）使得CHANGE-seq-BE可供大多數能夠使用短讀長高通量測序儀的實驗室使用。

另一個優勢是CHANGE-seq-BE能夠直接分析堿基編輯器活性，而不是依賴于核酸酶和堿基編輯器活性相同的錯誤假設。本研究結果清楚地表明，核酸酶和堿基編輯的脫靶活性在生化環境和細胞環境中均存在顯著差異。研究發現，在受控的細胞遞送條件下，ABE8e誘導了更多檢測到的脫靶位點以及相當高頻率的脫靶編輯活性。

CHANGE-seq-BE與支持IND申請的臨床基因組編輯方法的表征相關。本研究中的一個例子是，我們成功使用CHANGE-seq-BE提名候選脫靶位點，清除了一項IND申請，并用旨在糾正其致病突變的堿基編輯器治療了一名X-HIGM綜合征患者。

本研究一個有趣的觀察是，具有預期靶序列的gRNA在合成過程中常規色譜步驟期間可能被其他gRNA污染，這些低頻污染物在CHANGE-seq-BE等生化測定以及細胞中均導致了可測量的活性。每當使用合成gRNA時，考慮和測量污染gRNA的這種非預期“靶向”活性將很重要。

一個普遍的挑戰是潛在堿基編輯器脫靶位點的功能解釋。一旦得到更好的理解，可以應用幾種策略來減輕有害的脫靶效應并提高堿基編輯器的安全性和精確性。

總體而言，憑借高靈敏度和測序效率的有利特性，預計CHANGE-seq-BE將作為無偏發現方法，在生命科學研究和臨床應用中對表征堿基編輯器的全基因組gRNA依賴性脫靶活性方面得到越來越廣泛的應用。