引言：類胡蘿卜素的價值與生產挑戰

類胡蘿卜素是一類由異戊二烯單元構成的萜類色素分子，廣泛存在于光合生物中。根據其碳原子數可分為C₃₀、C₄₀和C₅₀類，其中C₄₀類胡蘿卜素因在自然界中含量豐富而被研究得最為深入。依據結構中的官能團，類胡蘿卜素可分為只含碳氫結構的胡蘿卜素（如β-胡蘿卜素、番茄紅素）和含氧的葉黃素（Xanthophylls），后者根據含氧官能團的不同又可進一步分為羥基類、環氧類和酮類胡蘿卜素。

類胡蘿卜素對人類健康至關重要，主要歸功于其強大的抗氧化特性。此外，它們還被報道具有抗病毒、抗糖尿病、抗癌和維生素A原活性。已證實的健康益處包括提高認知能力、降低慢性病風險、預防年齡相關性眼病等，因此在制藥行業受到關注。例如，β-胡蘿卜素是維生素A的前體，對眼睛功能起著關鍵作用。蝦青素則被建議通過抑制細胞因子風暴來增強COVID-19的治療效果。由于動物和人類無法自身合成類胡蘿卜素，必須通過飲食或補充劑攝入。因此，它們作為食品成分對人類健康有益。此外，類胡蘿卜素生物強化飼料和食品可能為對抗維生素A缺乏癥提供一種有前景的策略。它們通常用作食品著色劑、蛋黃和水生生物著色的天然色素。所有這些益處使其在多個行業中具有廣泛用途，并增加了對類胡蘿卜素的需求。類胡蘿卜素市場規模巨大，預計將從2017年的15億美元擴大到2026年的20億美元。

目前類胡蘿卜素的供應鏈主要依賴于植物提取和化學合成。然而，這些策略存在一些缺點和瓶頸。化學合成和植物提取過程中使用的有機溶劑會引發環境問題，而氣候多變性和季節性變化等因素影響植物的可獲得性。此外，種植富含類胡蘿卜素的植物成本高且耗時。由于化學合成產生的合成類胡蘿卜素可能導致毒性增加和過敏性等健康問題，這促使人們對微生物生產作為替代方案的興趣日益增長。微生物生產可以克服這些缺點和瓶頸，并提供一種更可持續和高效的方法。事實上，由于其可擴展性、效率和較低的成本，微生物生產對于滿足工業需求至關重要。目前，微藻、細菌和真菌常被用作類胡蘿卜素微生物生產者。此外，代謝工程策略促進了類胡蘿卜素在非天然微生物宿主中的生物合成。基因工程技術已被用于提高類胡蘿卜素的產量。

鑒于支持不斷增長的人口的可持續營養源的迫切需求，微生物生產平臺提供了一種可持續且環境友好的解決方案。合成生物學使得開發此類平臺以生產高價值營養素（如類胡蘿卜素）成為可能，這些營養素對視覺、免疫功能和抗氧化防御至關重要。特別是，CRISPR介導的代謝工程可以通過實現營養有價值化合物（包括類胡蘿卜素）的精密發酵，為全球糧食安全做出重大貢獻。基因工程微生物支持可持續的生產平臺，這些平臺可以獨立于農業限制（如氣候不穩定、土地稀缺和作物產量波動）而運行。本研究旨在通過提供可持續、環境友好且非植物基的食品成分生產，為全球實現聯合國可持續發展目標2（零饑餓）的努力做出貢獻。

植物相關微生物，即內生菌，是天然產物的可行來源。它們能夠合成具有多種生物活性的初級和次級代謝產物，這些代謝產物影響宿主代謝。因此，內生菌是新型生物活性化合物的豐富寶庫。此外，現代遺傳工具使得能夠改造內生菌，以利用其生產各種抗菌、抗病毒和抗癌分子的潛力。Pseudomonas sp. 102515最初是從中國紅豆杉葉片中分離得到的一種內生菌。在最近的研究中，該菌株經過生化鑒定，其基因組分析表明它是一個新的假單胞菌物種，并被重新命名為Pseudomonas loganensis sp. nov.。該分離株顯示黃色色素沉著，這導致發現它天然產生玉米黃質二葡萄糖苷。對其類胡蘿卜素生物合成基因簇的表征表明，通過敲除某些類胡蘿卜素基因，可以產生如番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃質等關鍵中間體。例如，crtY負責番茄紅素的環化，導致β-胡蘿卜素的生物合成。因此，敲除crtY會導致工程菌株中番茄紅素的積累。除了作為具有功能性生物合成基因簇的天然類胡蘿卜素生產者外，P. loganensis sp. nov. 能夠在相對較高的鹽濃度下生長，表明其內生生活方式可能賦予其鹽脅迫耐受性。這種耐鹽脅迫能力可以帶來經濟效益，因為它允許在工業發酵期間的高滲透壓條件下進行更有效的生產。此外，據報道它能夠從麥芽糖合成海藻糖，其固氮能力進一步強調了其在農業應用中的潛力。這些特性共同使P. loganensis sp. nov. 成為一個有吸引力的利基微生物底盤。

材料與方法

菌株、培養基和質粒

研究中使用的菌株和質粒列于表中。通常，大腸桿菌Top10細胞用于克隆實驗，而P. loganensis sp. nov. 用于遺傳操作和類胡蘿卜素生產。所有步驟均使用LB培養基進行細菌培養，根據需要添加細菌學瓊脂和抗生素。LB培養基補充有卡那霉素（大腸桿菌為50 μg/mL，P. loganensis sp. nov.為30 μg/mL）、氨芐青霉素（100 μg/mL）、慶大霉素（35 μg/mL）和四環素（大腸桿菌為10 μg/mL，P. loganensis sp. nov.為25 μg/mL）。培養條件維持在大腸桿菌Top10為37°C，P. loganensis sp. nov.為28°C，轉速均為220 rpm。

質粒構建

使用列出的引物通過Phusion DNA聚合酶進行PCR擴增。標準PCR反應在標準PCR條件下進行。為重疊延伸PCR開發了修改方案：反應混合物包含0.25 μM正向引物、0.25 μM反向引物、1×緩沖液、400 μM dNTPs、3% DMSO、可變量的模板、0.02 U/μL Phusion DNA聚合酶和高達20 μL的dH₂O。前20個循環在不加引物的情況下進行以允許片段重疊，之后加入引物，并在相同標準條件下繼續進行額外的循環。

構建帶有靶基因同源臂的pJOE載體：提取P. loganensis sp. nov.的基因組DNA作為模板，通過PCR擴增crtX、crtY和crtZ基因的上游和下游同源臂。擴增的同源臂從瓊脂糖凝膠中純化，通過重疊延伸PCR使用上游正向和下游反向引物進行雜交和擴增。用BamHI和PmlI限制性內切酶消化pJOE_pvdJ質粒。將消化后的pJOE_pvdJ和雜交的上游-下游同源臂從凝膠中純化，并通過吉布森組裝進行連接。通過限制性酶切分析和桑格測序驗證構建的質粒。

構建帶有靶基因N20序列的pgRNAtet載體：為了構建pgRNAtet，將質粒通過PCR擴增為兩個片段，并通過引物改變基因特異的N20 PAM序列。首先，使用pgRNAtet-F和pgRNAtet-R引物對獲得1.6 kb片段。然后，使用pgRNAtet-CrtXYZ-R和pgRNAtet-CrtX-F引物產生帶有crtX基因特異性N20序列的1.9 kb片段。這兩個PCR產物從瓊脂糖凝膠中純化，并通過吉布森組裝連接。對crtY和crtZ基因遵循相同的方案，但使用pgRNAtet-CrtY-F和pgRNAtet-CrtZ-F引物代替pgRNAtet-CrtX-F引物。通過限制性酶切分析和桑格測序驗證構建的質粒。

構建過表達質粒：將crtW基因合成為基因塊，用引物25-26通過PCR擴增，并從凝膠中純化。首先將平末端的PCR產物克隆到pJET1.2中，得到pNAr11。用于連接的體系包括50-100 ng載體、插入片段（載體/插入片段摩爾比為5:1）、1 μL 10× T4連接酶緩沖液、1 μL PEG緩沖液（用于平末端連接）、0.5 μL T4 DNA連接酶和高達10 μL的dH₂O。連接反應在冰上孵育30分鐘，然后在18°C過夜。用PmeI和SpeI切割構建體pNAr11和具有pMiS1載體骨架的載體pNAr17，從凝膠中收集并純化所需條帶。將從pNAr11限制性酶切獲得的粘性末端crtW片段，通過T4 DNA連接酶插入到從pNAr17酶切獲得的pMiS1載體骨架中，得到pNAr18。通過限制性酶切分析和桑格測序驗證構建的質粒。

P. loganensis sp. nov.的轉化和遺傳工程

通過電穿孔將質粒轉化到P. loganensis sp. nov.細胞中。根據文獻制備電感受態細胞。通過將培養物生長至OD₆₀₀~0.4，在冰上收集，并用300 mM蔗糖洗滌三次來制備電感受態細胞。將細胞重懸于100 μL蔗糖中，與質粒DNA混合，在冰上孵育10分鐘，然后在2.5 kV和25 μF條件下進行電穿孔。立即在1 mL LB中于28°C恢復2小時，然后涂布在選擇性LB瓊脂平板上，于28°C培養2天。將轉化子傳代培養并接種到含有適當抗生素的LB中供進一步使用。

對于λRed/Cas9介導的基因組編輯，根據Pfleger及其同事的方法進行兩步電穿孔。將含有pCas9的P. loganensis sp. nov.細胞用pJOE轉化，并在Gen35+Kan30 LB瓊脂平板上進行選擇。將種子培養物生長至OD₆₀₀~0.4，用0.2% L-阿拉伯糖誘導15分鐘，然后按照所述方案再次制備電感受態細胞用于pgRNAtet轉化。在Gen35+Tet25平板上選擇轉化子。

通過在無抗生素的LB中生長并反復劃線直至在選擇平板上無生長來去除CRISPR-Cas9質粒。然后將過表達質粒pNAr18引入無質粒的P. loganensis sp. nov. ΔcrtX細胞中，在Kan30 LB瓊脂上選擇轉化子。

類胡蘿卜素生產的搖瓶培養

將工程化P. loganensis sp. nov.菌株的單個菌落分別接種到5 mL含有適當抗生素的LB培養基中，在28°C、220 rpm振蕩培養2天。搖瓶培養以2天種子培養物的0.5%接種量開始，根據需要添加抗生素。6小時后，向P. loganensis sp. nov. ΔcrtX/pNAr18培養物中添加0.2% L-鼠李糖以誘導蝦青素生產。培養物在28°C、220 rpm振蕩培養5天后進行提取。

PCR確認

提取野生型P. loganensis sp. nov.和敲除菌株的基因組DNA，作為模板，使用相同的引物對確認crtX、crtY和crtZ基因的敲除。由于基因缺失，預期敲除菌株的DNA片段更短。對其它敲除菌株應用相同的方案，使用表中列出的引物對。

類胡蘿卜素提取

將培養5天的培養物在6000g離心10分鐘以收集細胞。棄去上清液，加入等量的丙酮:甲醇:氯仿混合物。對每50 mL培養物超聲處理1分鐘以促進類胡蘿卜素提取，然后在8000g離心15分鐘以去除細胞碎片。收集上清液并使用旋轉蒸發儀干燥。將殘留物重新溶解于丙酮:甲醇:氯仿溶劑混合物中用于進一步分析。

薄層色譜和高效液相色譜分析

使用涂有熒光指示劑F254的硅膠板進行薄層色譜分離類胡蘿卜素。展開劑由丙酮:正己烷:dH₂O組成。使用類胡蘿卜素標準品作為陽性對照，野生型P. loganensis sp. nov.提取物作為陰性對照。

通過高效液相色譜進一步分析提取的類胡蘿卜素。分析在反相C18分析柱上進行。HPLC儀器配備光電二極管陣列檢測器，色譜圖在454 nm處記錄。使用乙腈:甲醇:異丙醇作為流動相，采用等度洗脫方法分析提取的類胡蘿卜素，流速為1 mL/min，柱溫箱溫度為40°C。

使用響應面法優化培養基

將P. loganensis sp. nov.敲除和過表達菌株的單個菌落分別接種到5 mL LB培養基中獲得種子培養物。然后使用六種不同碳源和五種氮源進行試管實驗。所有碳源和氮源均單獨測試。此外，還測試了不同濃度的碳源和氮源、不同溫度和pH值范圍。每個試驗以1%的接種量開始，并獨立進行三次重復。在第3、5和7天收集樣品用于類胡蘿卜素提取。在每種類胡蘿卜素的特定OD值下分光光度法分析提取物，并使用真實的類胡蘿卜素標準品生成標準曲線。基于這些校準方程計算類胡蘿卜素濃度。HPLC分析的曲線下面積計算包含在滴度計算中，以排除雜質和其他類胡蘿卜素的貢獻。使用GraphPad Prism 8.0.2生成圖形并進行統計分析。根據p值表示顯著性水平。

在單獨確定最有效的碳源和氮源后，使用Design-Expert 7.0.0應用響應面法以確定增強類胡蘿卜素生產的最佳培養基。首先建立Box-Behnken設計以構建包含多個實驗因素的模型。執行BBD生成的實驗運行，軟件提供最佳設計參數。隨后在含有5 mL培養物的50 mL Falcon管和含有100 mL培養物的250 mL搖瓶中，使用獨立的三次重復驗證這些優化的培養基組成。此外，在優化的培養基組成和條件下測試了不同的接種量。使用Design-Expert 7.0.0版對RSM結果進行統計分析。

結果

通過P. loganensis sp. nov. ΔcrtX生產玉米黃質

在野生型P. loganensis sp. nov.的生物合成途徑中，最終產物是玉米黃質二葡萄糖苷，它是由玉米黃質通過玉米黃質葡萄糖基轉移酶（CrtX）催化向兩個β環添加葡萄糖分子而合成的。當crtX基因從基因組中敲除后，預期的最終產物是玉米黃質。通過PCR確認了crtX的敲除，產生了P. loganensis sp. nov. ΔcrtX菌株。首先使用TLC分析玉米黃質的生產，這是一種基于極性差異進行化合物分離的經濟高效且快速的色譜方法。

從P. loganensis sp. nov. ΔcrtX細胞沉淀中獲得的有機類胡蘿卜素提取物，使用所述方法通過HPLC進一步分析。突變菌株提取物和標準類胡蘿卜素的HPLC色譜圖顯示，所有樣品在3.53至3.92分鐘之間洗脫，形成兩個不同的峰。檢查它們的UV譜以確認這些峰對應于類胡蘿卜素。兩個峰具有幾乎相同的保留時間和UV譜，最大吸收在452 nm，證實它們代表玉米黃質異構體。此外，P. loganensis sp. nov. ΔcrtX提取物的HPLC分析顯示在9.64分鐘處有一個額外的峰，該峰表現出番茄紅素特有的UV譜。這一發現與TLC分析一致。在已鑒定的P. loganensis sp. nov.類胡蘿卜素生物合成基因簇中，crtY基因位于crtX基因的下游。由于細菌轉錄的多順反子性質，靶向單個基因可能潛在地破壞上游和下游基因的轉錄和翻譯。因此，在P. loganensis sp. nov. ΔcrtX中觀察到的番茄紅素積累可能是由于crtX敲除后crtY表達受損所致。在基因組中，crtX和crtY相鄰定位，敲除crtX可能影響了crtY的表達。這種影響似乎是部分的，因為仍然產生玉米黃質；然而，由于它們位于同一個操縱子中，crtY的表達很可能因crtX缺失而降低。

為了確定玉米黃質生產的最佳條件，單獨測試了各種參數，包括不同的碳源、氮源、溫度和pH值。根據滴度，甘油和鼠李糖被確定為玉米黃質生產最有效的碳源，而蛋白胨和麥芽提取物是最有效的氮源。在LB培養基的標準生長條件下，P. loganensis sp. nov. ΔcrtX產生約2.33 mg/L玉米黃質。補充0.5%甘油將產量提高到4.34 mg/L，大約是基礎培養基的2倍，而補充1%麥芽提取物進一步將產量提高到6.90 mg/L，幾乎是基礎條件的3倍。

為了構建具有三個自變量（甘油濃度、麥芽提取物濃度和培養時間）的BBD，選擇了這些參數。使用RSM統計評估這些參數對類胡蘿卜素生產的影響，并確定最佳培養基組成。預測的最佳組成為0.5%甘油、2%麥芽提取物和10天培養時間，預測生產滴度為15.61 mg/L。然后在優化的組成下，使用不同的接種量在Falcon管和搖瓶中進行驗證實驗。在這些條件下，P. loganensis sp. nov. ΔcrtX在Falcon管中以1%接種量產生約13.4 mg/L，在搖瓶中以2%接種量產生約11.3 mg/L。

如表S2所示，鼠李糖在P. loganensis sp. nov. ΔcrtX中提供了更大的玉米黃質滴度增強。然而，由于鼠李糖成本高于甘油，最初未使用鼠李糖進行BBD優化。盡管甘油作為碳源對于大規模應用具有經濟優勢，但后來使用三個自變量進行了BBD：鼠李糖濃度、麥芽提取物濃度和培養時間。統計評估這些參數對玉米黃質生產的影響，并通過RSM預測最佳培養基組成。預測的最佳組成為1.97%鼠李糖、1.98%麥芽提取物和9.45天培養時間，估計生產滴度為29.99 mg/L。評估了RSM模型的統計顯著性。對于包含甘油、麥芽提取物和培養時間的模型，F值為10.20，相應的p值為0.001，表明模型具有統計學顯著性。類似地，對于包含鼠李糖、麥芽提取物和培養時間的模型，F值為44.07，p值<0.0001，也表明具有很強的統計學顯著性。然后在優化的培養基條件下，使用不同的接種量在搖瓶中進行驗證實驗。以2%接種量獲得了35.0 mg/L玉米黃質的最高滴度，相對于LB基礎培養基提高了15倍。

通過P. loganensis sp. nov. ΔcrtZ生產β-胡蘿卜素

β-胡蘿卜素是一種呈現橙色的類胡蘿卜素，具有維生素A原活性。其β環被β-胡蘿卜素羥化酶（CrtZ）羥基化導致玉米黃質的形成。從野生型P. loganensis sp. nov.基因組中敲除crtZ基因，產生了P. loganensis sp. nov. ΔcrtZ菌株，該菌株產生β-胡蘿卜素作為最終產物。

與crtX敲除類似，通過PCR確認了crtZ的敲除，并通過TLC分析了β-胡蘿卜素的生產。P. loganensis sp. nov. ΔcrtZ細胞沉淀的有機類胡蘿卜素提取物通過HPLC進一步分析。β-胡蘿卜素峰在14.90至15.36分鐘之間洗脫。標準和提取物均顯示出類胡蘿卜素特有的UV譜，最大吸收在452 nm。HPLC分析證實了crtZ敲除的成功和工程菌株中β-胡蘿卜素的生產。β-胡蘿卜素和番茄紅素都是非極性類胡蘿卜素，β-胡蘿卜素的極性略低于番茄紅素。因此，β-胡蘿卜素通常洗脫時間較晚，具體取決于流動相。然而，由于它們的極性差異極小，番茄紅素也可能根據流動相的極性在較晚的保留時間洗脫。

為了確定β-胡蘿卜素生產的最佳培養條件，單獨測試了各種參數。在碳源中，0.5%甘油最有效，產生19.15 mg/L的β-胡蘿卜素。在氮源中，1%麥芽提取物最有效，滴度為17.11 mg/L。在LB培養基的正常生長條件下，P. loganensis sp. nov. ΔcrtZ產生約4.72 mg/L β-胡蘿卜素。相比之下，補充0.5%甘油或1%麥芽提取物使產量提高了近4倍，分別達到19.15和17.11 mg/L。

為了構建BBD，選擇了三個獨立參數：甘油、麥芽提取物和培養時間。執行實驗運行，并使用RSM統計確定最佳培養基組成。β-胡蘿卜素生產的最佳組成預測為2%甘油、2%麥芽提取物和5天培養時間，預測滴度為27.47 mg/L。β-胡蘿卜素生產的RSM模型也經過統計驗證。模型的F值為7.44，相應的p值為0.0038，表明模型具有統計學顯著性。然后在優化的培養基組成下，使用不同的接種量在Falcon管和搖瓶中進行實驗。P. loganensis sp. nov. ΔcrtZ在Falcon管中以1%接種量產生約23.53 mg/L β-胡蘿卜素，在搖瓶中產生21.74 mg/L。

通過P. loganensis sp. nov. ΔcrtY生產番茄紅素

番茄紅素是第一個C40類胡蘿卜素，其結構中缺乏環狀基團。它通過番茄紅素環化酶的催化作用作為合成環狀和雙環類胡蘿卜素的前體。番茄紅素β-環化酶（CrtY）在番茄紅素的兩端引入β環，將其轉化為β-胡蘿卜素。由于crtY基因從野生型P. loganensis sp. nov.基因組中敲除，預期的最終產物是番茄紅素。通過PCR確認了crtY的敲除，并通過TLC分析了P. loganensis sp. nov. ΔcrtY的有機類胡蘿卜素提取物，確認了番茄紅素的生產。

從P. loganensis sp. nov. ΔcrtY細胞沉淀中獲得的有機類胡蘿卜素提取物然后通過HPLC分析，確認番茄紅素生產的色譜圖如圖所示。在所有樣品中，相應的番茄紅素峰在9.34至9.54分鐘之間洗脫。這些峰的UV譜如圖所示。UV吸收譜顯示出三個峰，最大值在444、471和503 nm，與文獻中報道的番茄紅素一致。這些發現證實了crtY基因的成功敲除和工程菌株中番茄紅素的生物合成。

在隨后的番茄紅素生產優化過程中，單獨測試了相同的參數。在碳源中，甘油最有效，番茄紅素滴度為5.47 mg/L。類似地，麥芽提取物被確定為最有效的氮源，番茄紅素滴度為3.95 mg/L。在正常生長培養基下，P. loganensis sp. nov. ΔcrtY產生約2.02 mg/L番茄紅素。補充2%甘油將滴度提高到5.47 mg/L，大約是正常條件下的兩倍，而添加1%麥芽提取物產生3.95 mg/L番茄紅素，也顯著高于基礎培養基。

為了進一步優化工程菌株中的番茄紅素生產，使用三個獨立參數構建了BBD：甘油、麥芽提取物和培養時間。執行實驗運行，結果使用Design-Expert 7.0.0進行統計評估，并通過RSM用于確定最佳培養基組成。預測最佳培養基組成為0.57%甘油、1.94%麥芽提取物和9.97天培養時間，預測番茄紅素滴度為13.5 mg/L。番茄紅素生產的RSM模型具有統計學顯著性，F值為26.75，相應的p值為0.0001。在優化條件下，使用不同的接種量在Falcon管和搖瓶中進行驗證實驗。P. loganensis sp. nov. ΔcrtY在Falcon管中以1%接種量產生約9.67 mg/L番茄紅素，在