鐵死亡的治療性激活是誘導(dǎo)癌細胞死亡的一種潛在策略。解讀鐵死亡的表觀遺傳調(diào)控可能為增強癌細胞鐵死亡的有效方法提供見解。本研究首次鑒定出CRB2作為頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）中鐵死亡的表觀遺傳調(diào)節(jié)劑。CRB2的表達與鐵死亡相關(guān)基因的表達相關(guān)，并與HNSCC患者的良好預(yù)后相關(guān)。鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin和RSL3顯著增加CRB2表達，而過表達CRB2使HNSCC對鐵死亡敏感，在體外和體內(nèi)抑制生長。CRB2上調(diào)導(dǎo)致鐵死亡抑制劑SLC7A11啟動子區(qū)域的組蛋白H4第20位賴氨酸二甲基化（H4K20me2）增加，從而表觀遺傳地抑制其轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)HNSCC鐵死亡。機制上，CRB2阻礙組蛋白賴氨酸去甲基化酶LSD1的E8A亞型（LSD1(E8A)）與去泛素化酶USP7之間的相互作用，從而促進LSD1(E8A)的降解，隨后增加H4K20me2水平。這些結(jié)果表明CRB2通過激活表觀遺傳軸刺激鐵死亡，提示CRB2的上調(diào)是HNSCC的潛在治療策略。

頭頸部腫瘤是常見的上呼吸道腫瘤，與煙草和酒精的過度消費密切相關(guān)；約90%的病例病理診斷為頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）。盡管以手術(shù)為主的療法結(jié)合放療、化療、靶向治療和免疫治療持續(xù)改進，但HNSCC患者的5年生存率仍然停滯不前。因此，鑒定監(jiān)測癌癥進展和預(yù)后的新分子，并確定潛在靶點以探索有價值的治療策略，對于進一步提高HNSCC患者的臨床療效迫在眉睫。

鐵死亡作為一種新型的非凋亡調(diào)節(jié)性細胞死亡，由鐵依賴性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和致死性活性氧（ROS）的過度積累驅(qū)動。鐵死亡的特征是典型的形態(tài)學(xué)變化，如線粒體變小、嵴減少、線粒體膜密度增加和外膜破裂。腫瘤抑制因子、癌基因及其下游信號通路的擾動介導(dǎo)鐵死亡，有助于多種病理過程，包括腫瘤生物學(xué)和癌癥治療。鐵死亡的發(fā)生涉及鐵死亡誘導(dǎo)與其防御系統(tǒng)之間的失衡，這些系統(tǒng)包括二氫乳清酸脫氫酶（DHODH）-泛醇（CoQH₂）系統(tǒng)、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）-還原型谷胱甘肽（GSH）系統(tǒng)、鐵死亡抑制蛋白1（FSP1）-CoQH₂系統(tǒng)和GTP環(huán)水解酶1-四氫生物蝶呤系統(tǒng)。在某些情況下，癌細胞依賴鐵死亡在化療、放療和免疫治療等治療條件下生存。由于這些治療在晚期HNSCC患者中的重要性，靶向鐵死亡可能為對這些常規(guī)療法難治的HNSCC患者提供潛在的治療機會。

表觀遺傳學(xué)通過DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA的作用機制修飾基因表達，而不是改變DNA序列。DNMT1介導(dǎo)的CDO1高甲基化抑制子宮內(nèi)膜癌中的鐵死亡，而DNMT1對GPX4啟動子的高甲基化加劇骨質(zhì)疏松癥中的成骨細胞鐵死亡。作為一種關(guān)鍵的基因調(diào)控機制，表觀遺傳修飾在鐵死亡中的確切作用尚不清楚。解讀鐵死亡的表觀遺傳調(diào)控為藥物開發(fā)，尤其是抗癌藥物，鋪平了道路。

本研究發(fā)現(xiàn)，CRB2通過阻礙LSD1(E8A)與USP7的相互作用，抑制LSD1(E8A)的穩(wěn)定性和去甲基化酶活性，導(dǎo)致SLC7A11（也稱為xCT）啟動子區(qū)域內(nèi)組蛋白H4第20位賴氨酸二甲基化（H4K20me2）升高，從而抑制SLC7A11-GPX4信號通路并最終誘導(dǎo)鐵死亡。這些結(jié)果表明CRB2在鐵死亡誘導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，突出了其在HNSCC治療中的潛力。

從PathCards網(wǎng)站獲取39個鐵死亡核心基因。從UCSC Xena下載HNSCC（TCGA）的基因表達數(shù)據(jù)和患者生存數(shù)據(jù)（n = 499）。使用39個鐵死亡核心基因作為輸入進行基因集變異分析（GSVA），獲得鐵死亡核心指數(shù)（FCI）。對FCI低與FCI高患者的mRNA表達數(shù)據(jù)進行分析，并通過Venn方法與表觀遺傳數(shù)據(jù)相交。使用Kaplan-Meier方法進行預(yù)后分析，并使用對數(shù)秩檢驗進行評估。

使用多個人HNSCC細胞系（Tu686, HN8, JHU011, SCC17B, Fadu, SCC4）和人口腔黏膜癌前病變細胞系DOK以及人胚胎腎HEK293T細胞。細胞在含10% FBS和抗生素的相應(yīng)培養(yǎng)基中于37°C、5% CO₂培養(yǎng)。所有細胞系均排除支原體污染，并在解凍后15代內(nèi)使用。

使用列于補充表中的抗體。鐵死亡誘導(dǎo)劑（erastin, RSL3, IKE）和抑制劑（Fer-1）等化學(xué)品購自Selleck Chemicals。

使用TRIzol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBR Green Master Mix在ABI 7500HT系統(tǒng)上進行實時PCR。使用2^?ΔΔCT方法量化基因表達，以β-肌動蛋白表達為內(nèi)參。

總蛋白通過SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜后與一抗孵育，再與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育。使用β-肌動蛋白、GAPDH或α-微管蛋白作為內(nèi)參。對于IP，細胞裂解液與指定抗體和蛋白G珠或標簽磁珠孵育過夜，洗脫后通過Western Blot或LC/MS-MS分析。

使用慢病毒系統(tǒng)生成穩(wěn)定過表達CRB2和敲低CRB2或LSD1的HNSCC細胞系。使用siRNA進行CRB2的瞬時敲低。轉(zhuǎn)染效率通過Western Blotting評估。

使用CCK8試劑盒評估細胞在不同藥物處理72小時后的活力。

使用BODIPY 581/591 C11探針通過流式細胞術(shù)檢測脂質(zhì)過氧化水平。

通過檢測細胞內(nèi)GSH水平來評估胱氨酸攝取，使用總GSH測定試劑盒。

用于分析線粒體的超微結(jié)構(gòu)。細胞經(jīng)固定、脫水、包埋后制備超薄切片，染色后觀察。

用羅丹明123染色線粒體，使用SIM捕獲圖像。

細胞固定、透化、封閉后與一抗和二抗孵育，DAPI染色后通過熒光顯微鏡觀察。

使用ChIP試劑盒進行實驗。染色質(zhì)經(jīng)消化和超聲處理后與抗體孵育，富集的DNA片段通過qPCR或ChIP-seq進行分析。

將SLC7A11啟動子報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細胞，檢測熒光素酶活性以評估啟動子轉(zhuǎn)錄活性。

將Fadu細胞皮下注射到裸鼠右腋窩，待腫瘤體積達到約80 mm³時，隨機分組并用IKE處理。監(jiān)測腫瘤體積和小鼠狀態(tài)。

從2000年1月至2005年10月在我科接受手術(shù)的114名HNSCC患者中獲取樣本。前瞻性收集2025年3月至4月間27名患者的新鮮組織樣本用于分子分析。研究經(jīng)倫理委員會批準。

使用二步法檢測試劑盒進行IHC染色。通過染色強度（1+-4+）和染色范圍（0-4）計算染色評分（SI），將蛋白表達分為低表達（SI = 0–5）和高表達（SI = 6–12）。

定量數(shù)據(jù)以均值±標準差表示。使用GraphPad Prism進行統(tǒng)計分析和作圖。使用雙尾Student t檢驗、Wilcoxon秩和檢驗、雙向ANOVA或χ²分析。使用單變量和多變量Cox回歸分析獨立預(yù)后因素。P < 0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

通過生物信息學(xué)分析策略，將HNSCC樣本分為FCI高和低兩組。FCI高的患者總生存率更好。差異表達基因與表觀遺傳基因相交后，鑒定出19個表觀遺傳調(diào)節(jié)因子。其中10個基因在腫瘤與癌旁組織中存在差異表達。Kaplan-Meier分析確定ZBTB7C、SATB1、SCML4和CRB2這4個基因的高表達預(yù)示HNSCC患者更好的預(yù)后。用鐵死亡誘導(dǎo)劑處理HNSCC細胞后，qPCR和Western Blotting顯示erastin和RSL3顯著上調(diào)CRB2的mRNA和蛋白水平，而其他三個基因變化不一致或不顯著。因此，研究聚焦于CRB2。

CRB2在各種HNSCC細胞系中表達水平不同。在CRB2蛋白水平最低的Fadu細胞中過表達CRB2，增強了其對erastin誘導(dǎo)的鐵死亡的敏感性，呈劑量依賴性。平板克隆形成實驗顯示CRB2可抑制細胞活力。CRB2驅(qū)動的表型可被鐵死亡抑制劑Fer-1顯著阻斷，但不受凋亡抑制劑（Z-VAD-FMK）和自噬抑制劑（3-甲基腺嘌呤）影響。流式細胞術(shù)檢測顯示CRB2過表達顯著提高了erastin觸發(fā)的脂質(zhì)過氧化水平，細胞內(nèi)GSH/GSSG水平下降。TEM和SIM分析證實CRB2過表達的Fadu細胞表現(xiàn)出鐵死亡典型的線粒體形態(tài)變化。在體內(nèi)異種移植模型中，CRB2過表達和鐵死亡誘導(dǎo)劑IKE均能抑制Fadu細胞生長，且CRB2過表達顯著提高了IKE的抗腫瘤效率。這些結(jié)果表明CRB2在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)HNSCC鐵死亡并抑制腫瘤生長。

對CRB2過表達的Fadu細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得623個差異表達基因（DEG），與鐵死亡數(shù)據(jù)庫中的259個基因相交，鑒定出20個潛在的下游靶點。GO和KEGG富集分析揭示了CRB2調(diào)控的生物學(xué)過程和通路。在排名前5的DEG中，qPCR證實只有SLC7A11在CRB2過表達的兩種HNSCC細胞系中顯著下調(diào)。Western Blotting和體內(nèi)異種移植瘤實驗進一步驗證CRB2導(dǎo)致SLC7A11蛋白水平顯著下調(diào)，而對FSP1或DHODH蛋白影響不顯著。這些數(shù)據(jù)表明CRB2可能特異性抑制SLC7A11-GPX4信號通路，從而促進HNSCC鐵死亡。

研究發(fā)現(xiàn)CRB2增加了HNSCC細胞和異種移植瘤中H4K20me2的水平，而不是H4K20me1或H4K20me3。CRB2敲低則降低了H4K20me2水平，并伴隨SLC7A11和GPX4的上調(diào)。ChIP-seq分析顯示，CRB2調(diào)控的H4K20me2結(jié)合的DNA片段定位于啟動子區(qū)域，并包含鐵死亡相關(guān)基因SLC7A11。ChIP-qPCR證實H4K20me2確實與SLC7A11的啟動子區(qū)域結(jié)合，且這種結(jié)合在CRB2過表達的HNSCC細胞中更為明顯，而H4K20me1和H4K20me3未受影響。這種表觀遺傳啟動子調(diào)控未在GPX4的啟動子區(qū)域觀察到。熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C明CRB2過表達確實抑制了SLC7A11的轉(zhuǎn)錄活性。這些數(shù)據(jù)提示CRB2通過增加H4K20me2，表觀遺傳地沉默SLC7A11表達，而非GPX4。

qPCR顯示CRB2并未顯著且一致地改變H4K20me2相關(guān)mRNA水平。蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析確定CRB2與兩種組蛋白去甲基化酶LSD1（KDM1A）和RAD23B（HR23B）相互作用。CRB2的強制表達下調(diào)了LSD1，而非RAD23B。LSD1主要去甲基化H3K4和H3K9，而其去甲基化H4K20僅由神經(jīng)元特異性亞型LSD1(E8A)調(diào)節(jié)。研究驗證了LSD1(E8A)在多種HNSCC細胞系和癌癥標本中的表達。ChIP-seq顯示過表達LSD1(E8A)降低了3809個靶基因上的H4K20me2活性。在CRB2過表達的細胞中表達LSD1(非E8A)和LSD1(E8A)，發(fā)現(xiàn)只有LSD1(E8A)過表達能特異性抑制CRB2介導(dǎo)的H4K20me2上調(diào)。雖然LSD1(E8A)和LSD1(非E8A)均能抑制CRB2誘導(dǎo)的鐵死亡敏感性變化，但LSD1(E8A)表現(xiàn)出更強的抑制作用。這表明CRB2通過抑制去甲基化酶亞型LSD1(E8A)而非LSD1(非E8A)來提升H4K20me2。

CRB2加速了用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺處理的細胞中LSD1(E8A)的蛋白降解。用蛋白酶體抑制劑MG132處理時，在CRB2過表達細胞中觀察到LSD1(E8A)蛋白增加。此外，CRB2導(dǎo)致Fadu細胞中LSD1(E8A)的泛素化增加，而在CRB2抑制的Tu686細胞中則相反。IP實驗驗證了LSD1(E8A)確實與CRB2在HNSCC細胞中相互作用。共聚焦熒光顯微鏡觀察到LSD1(E8A)與CRB2在細胞質(zhì)和細胞核中共定位。內(nèi)源性表達的LSD1也觀察到類似的蛋白穩(wěn)定性和亞細胞共定位調(diào)控模式。蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)CRB2僅與去泛素化酶USP7相互作用。CRB2削弱了USP7與LSD1(E8A)的結(jié)合能力。相反，當CRB2被敲低時，這種結(jié)合能力增強。相應(yīng)地，USP7的過表達逆轉(zhuǎn)了由CRB2引起的對鐵死亡誘導(dǎo)劑敏感性的降低。總之，CRB2阻礙去泛素化酶USP7與LSD1(E8A)之間的相互作用，從而促進亞型蛋白LSD1(E8A)的降解，這有助于H4K20me2的升高。

TCGA-HNSCC數(shù)據(jù)和新收集的HNSCC樣本均顯示，與正常黏膜相比，癌樣本中CRB2顯著降低。通過IHC檢測HNSCC樣本中CRB2、H4K20me2和SLC7A11的蛋白水平。Kaplan-Meier圖顯示CRB2高表達患者總預(yù)后良好。單變量和多變量Cox回歸分析均證實CRB2是HNSCC患者的獨立生存保護因子。CRB2蛋白表達評分與H4K20me2呈正相關(guān)，與SLC7A11呈負相關(guān)。這些數(shù)據(jù)揭示了CRB2-H4K20me2-SLC7A11在HNSCC中的臨床相關(guān)性。

本研究證明CRB2通過在體外和體內(nèi)抑制SLC7A11-GPX4信號通路促進HNSCC鐵死亡。機制上，CRB2阻礙LSD1(E8A)亞型與去泛素化酶USP7的相互作用， destabilizes 并加速LSD1(E8A)的蛋白降解，最終導(dǎo)致H4K20me2在SLC7A11啟動子區(qū)域的特異性富集。因此，CRB2表觀遺傳地抑制SLC7A11的轉(zhuǎn)錄并促進HNSCC鐵死亡。

作為氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵門戶，SLC7A11維持GSH水平以對抗細胞氧化應(yīng)激并抑制鐵死亡。先前研究揭示了多種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶在不同生理病理條件下表觀遺傳調(diào)控SLC7A11。本研究首次確定CRB2以特定的H4K20me2介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控方式關(guān)閉SLC7A11的轉(zhuǎn)錄。研究還排除了CRB2不影響DHODH和FSP1水平的可能性。

CRB2作為Crumbs細胞極性復(fù)合體的蛋白質(zhì)組分，與不同蛋白質(zhì)相互作用并參與多種細胞過程。與膠質(zhì)母細胞瘤中CRB2過表達預(yù)示不良臨床結(jié)局不同，本研究顯示CRB2作為腫瘤抑制因子，通過促進鐵死亡抑制腫瘤生長，其過表達與HNSCC患者良好預(yù)后緊密相關(guān)。因此，CRB2對惡性行為的影響可能是癌癥類型特異性的。

在HNSCC細胞系中，盡管CRB2表達水平相當，但對鐵死亡誘導(dǎo)劑的藥理學(xué)反應(yīng)性存在差異，這強化了CRB2-鐵死亡軸的關(guān)聯(lián)，并提出CRB2增強作為一種合理的治療策略。有趣的是，鐵死亡誘導(dǎo)上調(diào)CRB2表達，而CRB2也促進鐵死亡，表明HNSCC中存在潛在的調(diào)控回路。雖然鐵死亡相關(guān)的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增強了STAT4的轉(zhuǎn)錄活性，提示存在脂質(zhì)ROS介導(dǎo)的前饋機制驅(qū)動CRB2表達，但這些數(shù)據(jù)揭示了STAT4與此調(diào)控電路的功能聯(lián)系。

多項研究證實CRB2快速定位DNA損傷位點并與H4K20的甲基化狀態(tài)相關(guān)。本研究揭示了CRB2如何增加H4K20甲基化。CRB2阻礙去泛素化酶USP7與LSD1(E8A)和LSD1的相互作用，導(dǎo)致蛋白泛素化水平升高。與先前報道一致，LSD1蛋白穩(wěn)定性在乳腺癌和膠質(zhì)母細胞瘤中受USP7調(diào)控。眾所周知，LSD1是一種主要調(diào)控H3K4或H3K9位點的組蛋白去甲基化酶，它可能通過SLC7A11在肺癌中發(fā)揮促鐵死亡作用，或在非癌癥疾病中發(fā)揮抑制作用。然而，本研究揭示CRB2通過亞型蛋白LSD1(E8A)而非LSD1特異性提升H4K20me2，這是本研究的一個亮點。LSD