細(xì)胞表面蛋白是大多數(shù)臨床可操作的目標(biāo)，對(duì)細(xì)胞通信、信號(hào)傳導(dǎo)和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。然而，針對(duì)這些目標(biāo)生成高親和力分子探針（如適配體）的方法仍然有限。目前的方法通量較低，且常常會(huì)破壞天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象，導(dǎo)致大多數(shù)這些目標(biāo)未被充分探索，從而阻礙了基于適配體的診斷和治療開(kāi)發(fā)。

我們假設(shè)，結(jié)合CRISPR介導(dǎo)的基因擾動(dòng)與單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)的多模式方法可以克服傳統(tǒng)適配體篩選的局限性。通過(guò)在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)分析基因擾動(dòng)、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)結(jié)合，我們建立了單細(xì)胞擾動(dòng)驅(qū)動(dòng)的適配體識(shí)別和動(dòng)力學(xué)測(cè)序（SPARK-seq）平臺(tái)，該平臺(tái)能夠在天然細(xì)胞環(huán)境中實(shí)現(xiàn)適配體-目標(biāo)相互作用的高通量映射。這種集成設(shè)計(jì)不僅有助于識(shí)別低豐度目標(biāo)的結(jié)合劑，還將發(fā)現(xiàn)過(guò)程與動(dòng)力學(xué)分析直接結(jié)合起來(lái)，加速了精確分子工具的開(kāi)發(fā)。

我們應(yīng)用SPARK-seq通過(guò)多重CRISPR敲除技術(shù)與單細(xì)胞mRNA及適配體測(cè)序相結(jié)合，系統(tǒng)地研究了適配體-目標(biāo)相互作用。經(jīng)過(guò)四輪Cell-SELEX（通過(guò)指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化配體）富集后，將適配體庫(kù)與經(jīng)過(guò)CRISPR敲除13種表面蛋白的細(xì)胞群體進(jìn)行了篩選。單細(xì)胞測(cè)序能夠同時(shí)檢測(cè)gRNA、轉(zhuǎn)錄組和適配體結(jié)合事件，從而將基因擾動(dòng)與適配體結(jié)合特征聯(lián)系起來(lái)。

利用我們的計(jì)算流程——單細(xì)胞擾動(dòng)-適配體識(shí)別和靶向適配體生成算法（SPARTA），我們分析了8466個(gè)高質(zhì)量的單細(xì)胞樣本，并將前10,000個(gè)獨(dú)特的適配體序列聚類為1906個(gè)家族。差異結(jié)合分析識(shí)別出5535個(gè)針對(duì)8種不同表面蛋白的適配體序列。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、表面等離子體共振和微尺度熱泳的驗(yàn)證確認(rèn)了目標(biāo)的特異性和納摩爾親和力。該方法還解析了復(fù)雜的結(jié)合模式，包括一種識(shí)別ITGA3/ITGB1整合素的適配體以及一種能結(jié)合多個(gè)PTPR同源物的適配體。

SPARK-seq優(yōu)先富集解離速率較慢的適配體（k_off）。在多個(gè)目標(biāo)中，結(jié)合差異（?log2FC）與k_off有很強(qiáng)的相關(guān)性（R2 = 0.8至0.9），但與平衡親和力（K_D）無(wú)關(guān)，這突顯了該平臺(tái)能夠分離出與目標(biāo)長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合的適配體的能力，這是治療和診斷應(yīng)用的關(guān)鍵特征。利用這些數(shù)據(jù)，SPARTA基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的分類器在預(yù)測(cè)PTK7結(jié)合序列方面的準(zhǔn)確率達(dá)到了約97%，其生成模塊還產(chǎn)生了具有改進(jìn)動(dòng)力學(xué)特性的功能性變體。

SPARK-seq是一個(gè)集成平臺(tái)，結(jié)合了CRISPR介導(dǎo)的基因擾動(dòng)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基于序列的適配體分析，并通過(guò)SPARTA深度學(xué)習(xí)框架進(jìn)行了增強(qiáng)。這項(xiàng)工作為“適配組學(xué)”奠定了基礎(chǔ)，這是一種多組學(xué)支持的技術(shù)，用于大規(guī)模、基于測(cè)序的適配體結(jié)合特異性和目標(biāo)屬性解碼。通過(guò)將數(shù)百萬(wàn)個(gè)適配體結(jié)合事件轉(zhuǎn)化為與遺傳和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)相關(guān)的高維測(cè)序數(shù)據(jù)，SPARK-seq能夠在數(shù)千個(gè)單個(gè)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因型-表型-配體之間的直接映射。這種多模式策略擴(kuò)展了檢測(cè)低豐度和構(gòu)象敏感目標(biāo)的動(dòng)態(tài)范圍，在序列分辨率上解析了動(dòng)力學(xué)和富集模式，并支持快速、可擴(kuò)展的高特異性適配體發(fā)現(xiàn)和合理優(yōu)化，為先進(jìn)的診斷和治療應(yīng)用鋪平了道路。

細(xì)胞表面蛋白是關(guān)鍵的疾病生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，然而針對(duì)這些蛋白的原位高通量適配體發(fā)現(xiàn)方法仍然有限。我們引入了單細(xì)胞擾動(dòng)驅(qū)動(dòng)的適配體識(shí)別和動(dòng)力學(xué)測(cè)序（SPARK-seq），這是一個(gè)將單細(xì)胞信使RNA和適配體測(cè)序與CRISPR介導(dǎo)的表面蛋白擾動(dòng)相結(jié)合的高通量平臺(tái)。在單次實(shí)驗(yàn)中，SPARK-seq同時(shí)將5535個(gè)不同的適配體映射到8種表面蛋白上，涵蓋了超過(guò)兩個(gè)數(shù)量級(jí)的蛋白質(zhì)豐度差異和多種生物物理類別。該方法能夠區(qū)分密切相關(guān)的同源蛋白，且沒(méi)有可檢測(cè)的交叉反應(yīng)，并提供了動(dòng)力學(xué)信息，從而優(yōu)先選擇了解離速率較慢的適配體。利用這種動(dòng)力學(xué)多樣性，我們?cè)O(shè)計(jì)了具有改進(jìn)解離特性的適配體變體。SPARK-seq為高效發(fā)現(xiàn)和合理設(shè)計(jì)適配體及功能性核酸建立了平臺(tái)，為診斷和治療領(lǐng)域打開(kāi)了新的可能性。