轉甲狀腺素蛋白（Transthyretin, TTR）在人體內主要負責運輸甲狀腺激素和維生素A。然而，當TTR蛋白發生錯誤折疊并沉積在心臟、神經等組織中時，會引發一種致命的疾病——ATTR淀粉樣變性。這種疾病可分為由野生型TTR引起的獲得性ATTR（ATTRwt）和由TTR基因突變導致的遺傳性ATTR（hATTR）淀粉樣變性，影響著全球數十萬人的健康，患者生存期在出現癥狀后顯著縮短。傳統的治療方法，如穩定TTR蛋白四聚體結構的小分子藥物（如Vyndamax）或利用小干擾RNA（siRNA）及反義寡核苷酸（ASO）技術來抑制TTR合成，雖然能緩解癥狀，但大多需要長期乃至終身用藥，給患者帶來不小的負擔。

近年來，CRISPR-Cas9基因編輯技術為一次性根治遺傳性疾病帶來了曙光。其中，來自化膿鏈球菌的Cas9（SpCas9）蛋白應用最為廣泛。基于此技術的在體基因編輯療法NTLA-2001已在臨床試驗中顯示出能大幅降低TTR蛋白水平。然而，SpCas9就像一把不夠精確的“基因剪刀”，在切割目標基因的同時，也可能誤傷基因組的其他位置，即產生“脫靶編輯”。更令人擔憂的是，其造成的DNA雙鏈斷裂（DSB）可能導致染色體易位，嚴重威脅基因組完整性。盡管已有一些高保真變體如SpCas9-HF1、SpCas9-HF4和HiFi Cas9被開發出來，但它們在進行TTR基因編輯時的效率和安全性仍需全面評估。為了解決這些安全性瓶頸，推動高保真CRISPR-Cas9技術的臨床轉化，研究人員開展了這項系統性研究，相關成果發表在《SCIENCE ADVANCES》上。

為開展本研究，研究人員運用了多種關鍵技術方法：利用體外轉錄（IVT）合成編碼野生型（WT）及各種變體SpCas9的mRNA；設計并化學合成靶向TTR等基因的單向導RNA（sgRNA）；采用不同的脂質納米粒（LNP）配方（如LNP-01）用于體內外遞送mRNA和sgRNA；通過T7內切酶I（T7E1） assay、Western blot、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和擴增子測序（amplicon-seq）評估基因編輯效率和蛋白敲低效果；利用GUIDE-seq技術進行全基因組范圍的脫靶效應分析；采用引物延伸介導的測序（PEM-seq）檢測染色體易位事件；在TTR人源化小鼠模型和食蟹猴模型中評估體內編輯效果和安全性；將SpCas9-Mut5與腺嘌呤堿基編輯器ABE8e融合，構建ABE8e-mut5，并分析其編輯保真性和編輯窗口。

研究人員首先驗證了CRISPR-Cas9系統敲低TTR基因的能力。他們合成了高純度的WT SpCas9 mRNA，并設計了5條靶向TTR基因不同區域的sgRNA（sgTTR-1至sgTTR-5）。實驗證明，所有這些sgRNA都能引導WT SpCas9在HEK293T細胞中有效編輯TTR基因。其中，sgTTR-1、sgTTR-2和sgTTR-3引導的編輯能顯著降低HepG2細胞分泌的TTR蛋白水平。然而，生物信息學預測提示sgTTR-3可能導致大量脫靶編輯，因此后續研究主要聚焦于sgTTR-1和sgTTR-2。研究還發現，WT SpCas9以及已報道的高保真變體SpCas9-HF1和SpCas9-HF4在sgTTR-1引導下均能大幅降低TTR蛋白表達，但編輯效率存在差異。

利用GUIDE-seq技術進行全基因組脫靶分析發現，將WT SpCas9與sgTTR-1以1:1質量比共轉染HepG2細胞后，除了18號染色體上的靶位點，還在其他多條染色體上檢測到脫靶突變。相比之下，sgTTR-1誘導的脫靶位點數量遠少于sgTTR-2，表明sgTTR-1是更安全的sgRNA選擇。

為了優化體內遞送，研究人員在TTR人源化小鼠模型中測試了四種不同的LNP配方（LNP-01至LNP-04）。結果顯示，LNP-01在降低血清TTR蛋白水平和編輯肝臟TTR基因方面表現最佳且可重復。進一步優化LNP-01中sgTTR-1與SpCas9-HF1 mRNA的質量比發現，當比例為1:1時，基因編輯效率和TTR蛋白敲低效果達到最優。

即使在優化的1:1質量比條件下，SpCas9-HF1仍會在HepG2細胞中引起11個脫靶編輯，脫靶編輯頻率（脫靶編輯與靶向編輯的比值）為0.04。當sgTTR-1與mRNA比例調整為1:4時，脫靶位點增至28個，脫靶頻率升高至0.17。這表明即使是高保真變體，其保真性也會受到實驗條件的影響，且脫靶風險依然存在。

為了進一步提升SpCas9的保真性，研究人員對SpCas9-sgRNA-靶DNA復合物結構（PDB_ID: 5FW3）進行了分析，發現除了已知的關鍵殘基外，Lys⁵²⁶、Asn⁶⁹²、His⁶⁹⁸、Arg⁸⁹⁵和Arg⁹¹⁹等殘基的側鏈也靠近sgRNA或靶DNA的骨架，可能參與非特異性相互作用。基于此，他們理性設計了六個新型SpCas9變體（Mut1-Mut6），每個變體包含不同數量的丙氨酸（Ala）取代。T7E1實驗證實所有這些新變體均具有TTR基因編輯功能。

在TTR人源化小鼠模型中評估這六個新變體的體內編輯效率，發現它們均能有效降低血清TTR蛋白水平，其中Mut5的敲低效果（93.4%）與WT SpCas9（91.6%）相當，表明引入的突變并未顯著損害其靶向編輯活性。關鍵的GUIDE-seq脫靶分析顯示，SpCas9-Mut5僅誘導了6個脫靶編輯位點，且均位于內含子或基因間區，其整體脫靶編輯頻率（0.014）遠低于WT SpCas9（0.894），也顯著低于SpCas9-HF1（0.045），證明SpCas9-Mut5是一種超保真變體。

單次給予TTR人源化小鼠1 mpk劑量的裝載有sgTTR-1和SpCas9-Mut5 mRNA的LNP-01后，血清TTR蛋白水平在給藥后第4天即下降約90%，并且這種敲低效果可持續至少168天（超過24周），證明了其持久的治療效果。

在食蟹猴原代肝細胞（PMHs）中，使用針對食蟹猴TTR基因設計的sgRNA（sgTTR-6），SpCas9-Mut5在32 nM濃度下實現了約89%的編輯效率，與WT SpCas9效果相當。在食蟹猴體內實驗中，單次靜脈輸注3 mpk劑量的LNP-01（裝載sgTTR-6和SpCas9-Mut5 mRNA）后，血清TTR水平在第4天下降約45%，并在第21天進一步下降至65-70%，證實了SpCas9-Mut5在非人靈長類動物模型中的有效性。

為了驗證SpCas9-Mut5的普適性，研究人員測試了其編輯其他疾病相關基因（如TRAC、ZC3H12A、VEGFA和EMX1）的能力。擴增子測序結果表明，SpCas9-Mut5在多數位點展示了與WT SpCas9相當甚至更優的靶向編輯效率，同時在這些位點已知的潛在脫靶位點上，其脫靶活性顯著低于WT SpCas9，進一步證實了其高保真性和廣泛適用性。

通過PEM-seq技術分析染色體易位事件發現，WT SpCas9編輯TTR基因后，易位率高達1.33%，且前五位的高頻易位均發生在靶位點與已識別的脫靶位點之間。相比之下，SpCas9-Mut5編輯后的易位率降至0.71%，且僅檢測到一例靶位點與脫靶位點之間的易位，顯著改善了基因組編輯的安全性。

研究人員將SpCas9-Mut5與ABE8e系統融合，構建了ABE8e-mut5堿基編輯器。在HEK293T細胞中，ABE8e-mut5在TTR、VEGFA、EMX1等多個基因位點保持了高效的靶向腺嘌呤（A）到鳥嘌呤（G）的轉換活性，但在相應的脫靶位點上，其編輯效率顯著低于ABE8e，表明SpCas9-Mut5的引入大幅增強了ABE系統的保真性。

對ABE8e-mut5和ABE8e在多個靶位點（如EMX1、HEK293T-2、F-site、ATGg2）的編輯窗口進行分析發現，ABE8e-mut5主要高效編輯位于Protospacer第4至第8位的腺嘌呤（A4-A8），而對于更遠位置的腺嘌呤（如A2, A3, A9-A14），其編輯效率則大幅降低。這與ABE8e寬泛的編輯窗口（可編輯A2-A14）形成鮮明對比，意味著ABE8e-mut5能有效減少 bystander（旁觀者）突變，實現更精準的堿基編輯。

本研究通過系統性實驗證實，新開發的SpCas9變體SpCas9-Mut5是一種兼具高效靶向編輯能力和超低保真性的基因編輯工具。它不僅能夠安全、長效地敲低TTR基因以治療ATTR淀粉樣變性，還展現出編輯多種疾病相關基因的潛力。更重要的是，SpCas9-Mut5能夠與ABE系統完美兼容，衍生出的ABE8e-mut5編輯器在保持高效堿基轉換能力的同時，顯著降低了脫靶編輯風險并縮窄了編輯窗口，從而極大提升了堿基編輯的安全性。這項研究不僅為ATTR淀粉樣變性的治療提供了更優的候選方案，也為其他遺傳性疾病的精準基因治療奠定了堅實的基礎，是基因編輯技術向臨床安全轉化的重要進展。未來，探索將SpCas9-Mut5與其他高保真變體的突變組合，以及將其應用于胞嘧啶堿基編輯器（CBE）中，有望進一步推動基因編輯工具的發展。