金黃色葡萄球菌克隆復合體59（CC59）已成為亞洲地區重要的公共衛生威脅，但其宿主適應和全球進化成功的機制尚不清楚。本研究對3,994株全球CC59分離株進行了全面的基因組分析，其中包括來自中國的549株血流感染相關分離株。分析揭示了三個具有區域特異性分布模式的系統發育 distinct 譜系，其起源可追溯至美國、澳大利亞和中國。值得注意的是，在臺灣地區流行的高風險CC59克隆很可能在20世紀40年代至60年代從中國大陸菌株中分化出來，這與1949年前后中國內戰導致的歷史性人口遷移時間相吻合。在中國相關的CC59菌株中，呼吸道定植與跨多個生態位的強傳播關聯性相關，表明其作為傳播樞紐的作用，特別是對于血流感染（BSI）。此外，我們觀察到Clf-Sdr家族蛋白在人類分離株中顯著富集，尤其是在BSI病例中。利用Δ^clfB和Δ^sdrD敲除菌株進行的功能表征顯示其生物被膜形成能力受損，這與在USA300中的發現一致。這些發現為CC59的監測建立了一個進化框架，并指出了抗毒力治療的潛在靶點。

金黃色葡萄球菌（S. aureus）是一種革蘭氏陽性機會性病原體，可引起從淺表傷口到危及生命的肺炎和菌血癥等多種感染。尤其值得關注的是，金黃色葡萄球菌菌血癥的死亡率高達20%–30%，構成了重大的全球健康負擔。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的出現，通過獲得葡萄球菌染色體mec（SCCmec）基因盒，加劇了這一威脅，使MRSA成為全球醫院內感染和社區感染的主要原因。

金黃色葡萄球菌序列分型（ST）的全球分布表現出顯著的地理差異。雖然ST8（USA300）在美國占主導地位，但ST239和ST59在東亞地區流行。在亞太地區，克隆復合體59（CC59），包括ST59及其單一位點變異型，已變得尤為普遍。盡管當前的研究主要集中在區域分析，特別是在亞太地區，但CC59在歐洲、美國（作為USA1000）和澳大利亞也有零星檢測到。盡管在北美和臺灣地區的金黃色葡萄球菌CC59譜系中觀察到毒力和抗生素耐藥性存在顯著差異，但CC59的全球種群結構仍不清楚。雖然有多項研究調查了臺灣和中國大陸CC59的局部進化和擴散，但關于其起源和傳播的相互矛盾的理論（提出其起源于北美隨后傳播到亞洲，或最初在臺灣出現然后進行全球傳播）凸顯了其進化軌跡仍存在不確定性。

由金黃色葡萄球菌引起的血流感染（BSI）由于其高死亡風險而成為一個重要的健康問題。2017年，美國報告了約119,247例金黃色葡萄球菌BSI病例，其中19,832例死亡。類似地，中國的一項多中心研究發現，在2861例BSI病例中，金黃色葡萄球菌占7.3%。雖然MRSA USA300已被廣泛用于研究BSI的潛在毒力機制，包括sarZ突變介導的凝聚因子B（ClfB）蛋白調控以增強其毒力，但關于亞洲主導的CC59菌株的發病機制卻鮮有報道。ClfB屬于識別粘附基質分子的微生物表面組分（MSCRAMMs），介導葡萄球菌對宿主細胞外基質成分的粘附。最近一項使用USA300的研究揭示，凝聚因子-絲氨酸天冬氨酸重復蛋白（Clf-Sdr）突變增強了生物被膜的形成。來自BSI的ST59和ST239的比較研究表明，ST59表現出葡萄球菌激酶（sak）和趨化抑制蛋白（chp）基因的更大富集。此外，ST398-t571分離株表現出與ST59-t437菌株不同的溶血素譜，表明γ-溶血素組分B（hlgb）基因可能在人血中賦予選擇優勢。當前的研究主要集中于識別區域性的高風險BSI克隆以及將CC59與其他克隆復合體進行比較。然而，導致BSI中毒力增強的CC59譜系內進化及其具體的致病機制在很大程度上仍未得到探索。

為了彌補這些知識空白，我們對全球金黃色葡萄球菌CC59菌株進行了全面的基因組分析，將我們的收集與公共數據庫整合。我們的研究旨在闡明種群譜系變異、表征耐藥和毒力基因譜、識別關鍵的發病決定因素，并通過時間標度的系統發育分析重建進化軌跡。

我們的數據集包含金黃色葡萄球菌CC59基因組序列的多樣化子集，來源包括我們內部的收集和公共可訪問的數據庫。在我們的收集中，共551株金黃色葡萄球菌CC59分離株于2011年至2024年間從中國22個省份的41家醫院收集。每株菌均使用MALDI-TOF MS光譜法鑒定到種水平。這551株分離株的測序在Illumina HiSeq X-Ten平臺上進行，采用2 × 150 bp雙末端讀長配置。使用FastQC v0.23.2對原始測序數據進行質量控制。隨后，使用SPAdes v3.15.5對高質量讀長進行組裝。此外，我們從GenBank數據庫下載了3,180個組裝基因組，從PubMLST下載了58個組裝基因組，最后訪問日期為2024年12月15日。此外，使用SPAdes v3.15.5組裝了NCBI SRA中可用的205個短讀長數據集，最終得到一個包含3,994個金黃色葡萄球菌基因組的數據集用于后續分析。所有組裝基因組均通過mlst v2.22.1確認為CC59。使用GTDB-Tk v2.4.0確認所有基因組為金黃色葡萄球菌。使用CheckM v1.1.6評估每個基因組的完整度和污染度，僅保留完整度超過95%且污染度低于5%的基因組用于進一步分析。

所有基因組使用Prokka v1.14.5進行注釋。使用綜合抗生素耐藥性數據庫（CARD v4.0.0）和耐藥基因標識符（RGI v6.0.3）以嚴格參數檢測抗生素耐藥基因（ARGs）。通過BLASTp搜索一個包含60%覆蓋度和同一性的定制數據庫來鑒定毒力因子（VFs）。使用spaTyper v0.2.1對所有金黃色葡萄球菌分離株進行spa分型。使用Bactopia v3.0.0的StaphopiaSCCmec模塊進行SCCmec分型。使用內部腳本通過PHASTEST API進行前噬菌體注釋。提取完整的前噬菌體并使用Pharokka v1.7.5進行注釋。使用Roary v3.13.0基于GFF格式的注釋基因組識別泛基因組。使用GraPPLE的pw_similarity.py腳本計算 pairwise Jaccard相似性系數。將所有組裝序列映射到金黃色葡萄球菌M013參考基因組以生成核心基因組單核苷酸多態性（SNP）比對。使用FastBAPS v1.1.4識別SNP比對中遺傳相似分離株的譜系。

使用Snippy v4.6.0生成的基因組比對調用核心基因組SNP（cgSNPs）。使用Gubbins v2.4.1去除重組位點。然后使用IQ-TREE v2.2.03基于去除重組后的核心基因組SNP比對構建最大似然系統發育樹。

通過比較人類宿主與其他宿主，以及人類血液與其他人類來源的分離株進行GWAS分析。為了識別與金黃色葡萄球菌CC59毒力潛能可能相關的基因，我們使用先前鑒定的VF的存在/缺失矩陣作為Scoary v1.6.13的輸入。使用fsm-lite v1.0生成不同長度的k-mer。使用Pyseer v1.3.10進行基于所有收集株k-mer組成的GWAS分析。將顯著關聯的k-mer進一步映射到金黃色葡萄球菌M013參考基因組以識別推定性狀特異性基因。

為了在染色體上敲除clfB和sdrD基因，我們使用了pKOR1質粒和所列引物。通過交叉PCR分兩輪產生插入片段。第一輪PCR擴增基因終止密碼子上游1 kb片段和下游1 kb片段。第二輪PCR將上游和下游片段合并成一個2 kb的擴增產物。將該片段通過冷融合連接到線性化的pKOR1質粒上，并通過測序確認質粒準確性。將質粒電轉化到RN4220和目的菌株后，按照pKOR1方案篩選基因替換。通過測序驗證染色體上目標基因（不含側翼區域）的缺失。

按照先前描述的方法，為兩株CC59分離株D4396和D4275生成clfB和絲氨酸-天冬氨酸重復蛋白D（sdrD）基因敲除株。將野生型和基因失活的金黃色葡萄球菌菌株在胰蛋白酶大豆肉湯中培養至OD₆₀₀為1。然后將培養物稀釋至OD₆₀₀為0.01，并在37°C、200 rpm振蕩培養24小時。每30分鐘測量一次OD₆₀₀以繪制生長曲線。使用statmod版本1.50中的compareGrowthCurves()函數進行置換檢驗分析生長曲線。為了評估生物被膜形成，將金黃色葡萄球菌培養物在TSB中于37°C培養18小時至OD₆₀₀為0.01。隨后，將200 μL培養物轉移到96孔板中，在37°C下再培養24小時。孵育后，用PBS洗滌孔三次，每孔加入25 μL 1%結晶紫溶液。將板在37°C孵育15分鐘。之后，去除結晶紫，再次用PBS洗滌孔三次。隨后，每孔加入200 μL 30%乙酸，在室溫下孵育10分鐘。最后，使用Multiskan SkyHigh光度計在600 nm處測量吸光度。

為了研究中國的金黃色葡萄球菌CC59，我們選擇了來自該地區的2,045個基因組。如前所述對所有基因組進行SNP比對。使用SNP-dists v0.8.2從去除重組前的核心基因組比對生成 pairwise SNP距離矩陣。先前的研究已經建立了金黃色葡萄球菌遺傳關聯性的 cutoff，表明12個cgSNPs的閾值可以在相似時間范圍內檢測到95%的傳播事件。由于缺乏支持的流行病學數據，我們將中國的跨源關聯定義為 pairwise 基因組顯示少于12個cgSNPs且在同年分離的情況。對于攜帶少于12個cgSNPs的基因組對，我們提取這些SNPs并將它們映射到參考基因組中的特定基因位置。

從數據集中，我們選擇了2,720個具有詳細收集時間和地點信息的基因組進行系統地理學分析。使用BactDating v1.1.1分析最大似然樹，估計金黃色葡萄球菌CC59的時間起源。使用skygrowth v0.3.1進行有效種群大小和時間標度系統發育的系統動力學推斷。使用TreeTime v0.11.4的遷移模型估計地理傳播模式。

使用經過Benjamini-Hochberg校正的Fisher精確檢驗進行每個BAPS譜系內VFs和ARGs的富集分析。使用Wilcoxon符號秩檢驗進行組間比較。本研究中的所有網絡使用Cytoscape v3.9.1創建。使用pyGenomeViz v1.5.0可視化遺傳比對，使用iTOL v6繪制系統發育樹。其他可視化使用ggplot2 v3.4.4制作。

共分析了3,994個金黃色葡萄球菌CC59基因組，包括來自中國41家醫院的551株臨床分離株和來自公共數據庫的3,443個基因組。其中242個缺乏詳細地理信息。其余3,752個基因組涵蓋29個地理區域，中國大陸的流行率最高（51.2%, 2,045/3,994）。在中國分離株中，代表了32個省級行政區，但827個缺乏具體的省級歸屬。浙江占比最高（6.60%, 135/2,045），緊隨其后的是湖北（6.3%, 129/2,045）。分離株收集于1994年至2024年間，峰值在2018-2019年。MRSA占收集株的71.9%（2,873/3,994），線性回歸模型顯示其隨時間有邊際增長。中國分離株對MRSA負擔的貢獻不成比例（91.1%, 1,863/2,045），而非中國地區為55.2%（943/1,707）。大多數分離株（86.8%, 3,466/3,994）來源于人類宿主，血流感染是主要的臨床來源（29.2%, 1,013/3,994），其中包括666株來自中國。

使用來自3,994個基因組的63,833個無重組SNP，以M013為參考基因組，重建了最大似然系統發育樹。去除重組后，共有1,863個位點被Gubbins過程消除。這些位點大部分位于SCCmec區域和前噬菌體區域。平均基因組大小為2.8 Mbp，產生一個包含17,356個基因的泛基因組和一個包含1,311個基因的核心基因組。種群結構分析揭示了三個遺傳上不同的簇（BAPS1-3），均主要由ST59組成。BAPS1（410個基因組）、BAPS2（1,208個基因組）和BAPS3（2,376個基因組）的簇內中位SNP距離分別為157、115和75，而簇間中位距離為198 ± 24.9。次要流行ST包括BAPS1中的ST375（18.8%, 77/410）、BAPS2中的ST87（25.1%, 303/1,208）和BAPS3中的ST338（9.6%, 228/2,376）。BAPS3主要是一個中國譜系，占基因組的75.9%（1,803/2,376），而BAPS2中的金黃色葡萄球菌CC59廣泛分布在美國（38.7%, 468/1,208）和英國（28.8%, 348/1,208）。BAPS1譜系全球分布，約一半源自中國（59.0%, 242/410），其次是歐洲地區（22.4%, 92/410）。

在118個已識別的spa型中，t437在全球占主導地位（45.7%），具有簇特異性分布：BAPS1中的t172（55.1%, 226/410）、BAPS2中的t216（49.6%, 599/1,208）和BAPS3中的t437（75.5%, 1,793/2,376）。MRSA在BAPS1和BAPS3簇中占主導地位，各占70%以上，而MSSA占BAPS2簇的70.9%。mecA基因主要位于SCCmecIVa型（40.8%, 1,630/3,994）上，其次是SCCmecVb型（19.1%, 761/3,994）。值得注意的是，攜帶SCCmecVb型的基因組主要來自BAPS3簇，占這些基因組的99.5%（757/761），且主要源自中國。

在金黃色葡萄球菌CC59中鑒定出163個VF基因，主要與外毒素產生、免疫調節、外酶活性、營養/代謝因子、粘附機制和效應子遞送系統相關。值得注意的是，與外毒素和免疫調節相關的VF數量高于其他類別。BAPS3攜帶的VF較少，中位數為106 ± 4.8。然而，值得注意的是，雙組分毒素lukS-PV/lukF-PV以及與外毒素產生相關的set基因在BAPS3中顯著富集。ARG譜包括79個基因，所有基因組都攜帶賦予氟喹諾酮類耐藥性的基因（nor和arl基因簇）。進一步比較BAPS簇發現，BAPS3攜帶的ARG數量更多，中位數為21 ± 3.5。此外，賦予β-內酰胺類抗生素和四環素耐藥的ARG在BAPS1和BAPS3簇的基因組中明顯更普遍。具體來說，BAPS3中富集的ARG包括mecA和tet(K)的存在。相比之下，BAPS2表現出大量富集的ARG，如ant、qac和fus。

作為金黃色葡萄球菌CC59中高度重組的區域之一，提取了所有完整的前噬菌體，共鑒定出4,423個前噬菌體。泛基因組矩陣使用 pairwise Jaccard相似性系數閾值>0.5將這些推定的前噬菌體分類為41個簇和96個單例。除了C1到C5簇，其他簇每個包含的前噬菌體少于10個。最大的簇C1包含3,176個前噬菌體，變異性最大，由17種不同的前噬菌體組成。主要的前噬菌體是φP282，占28.0%（889/3,176），其次是φSA345ruMSSAST8，占22.9%（727/3,176）。簇C2和C5主要由φJB和φ2958PVL組成，分別占其前噬菌體的90.7%（438/483）和75.4%（52/69）。在BAPS分布方面，簇C1–C5存在于所有三個BAPS簇的基因組中。然而，前噬菌體簇C3主要存在于BAPS1和BAPS3中，只有少量存在于BAPS2中（1.0%, 3/299）。大多數前噬菌體簇攜帶的VF數量有限，范圍在0到8之間，平均為1.6 ± 1.5。簇C1包含的VF數量顯著高于所有其他組，其中外毒素（lukS-PV/lukF-PV和sea）、外酶（sak）和免疫調節（scn）富集。具體來說，φ7247PVL和φSa2wa_st22攜帶lukS-PV/lukF-PV，而φNM3攜帶一個包含sea、sak、chp和scn的免疫逃避簇。金黃色葡萄球菌CC59中七個代表性前噬菌體的遺傳比對揭示了整合區、頭部和包裝區以及調控區的基本結構。

為了識別與人類感染相關的遺傳決定因素，進行了bGWAS，比較了3,466株人源分離株和353株非人源分離株。基于VF矩陣的bGWAS識別出15個在兩組間存在顯著差異的VF。值得注意的是，介導金黃色葡萄球菌在人血漿中凝聚的凝聚因子B（clfB）在人類分離株中顯著富集，顯示出超過60%的敏感性和特異性。bGWAS還識別出3,712個與人類分離株相關的k-mer，對應141個基因，包括屬于MSCRAMM家族的sdrD、sdrE、clfA和clfB。進行了專注于血流感染的廣泛比較分析，包括來自人血液樣本的1,013個基因組和來自其他人類來源的1,221個分離株。利用基于VF矩陣的bGWAS方法，發現16個VF在血流分離株中顯著更普遍。值得注意的是，MSCRAMM如sdrD、sdrE、sdrC和clfB以超過80%的高靈敏度被檢測到。此外，基于k-mer的bGWAS揭示了2,039個與血流基因組相關的k-mer，與54個基因相關聯。與泛基因組分析一致，sdr和clf基因在血流分離株中顯著富集。

為了研究MSCRAMM基因在金黃色葡萄球菌CC59侵襲過程中的作用，使用來自BAPS1的菌株D4275和D4369生成了clfB和sdrD基因的敲除突變株。生物被膜形成實驗表明，BAPS1敲除株的生物被膜形成顯著降低。敲除clfB或sdrD基因并未顯著改變BAPS1菌株的生長速率。

為了進一步研究中國地方性流行的CC59菌株，分析了來自中國的2,045株菌株，其中32.6%（666/2