《Developmental Biology》：Gsx2 Regulates Oligodendrocyte Precursor Formation in the Zebrafish Spinal Cord
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脊椎動物中樞神經系統中少突膠質細胞（OLs）的發育依賴神經前體細胞（NPCs）向少突膠質細胞前體（OPCs）的定向分化。本研究以斑馬魚為模型，通過單細胞RNA測序和單核細胞ATAC測序，發現pMN域NPCs中存在前OPCs亞群，其特異性表達Gsx2等少突膠質細胞相關轉錄因子。利用CRISPR/Cas9敲除gsx2基因，發現突變體胚胎在40 hpf時提前啟動OPC分化，并產生過量OPCs，但髓鞘形成過程未受影響。多組學數據構建了以Gsx2為核心的調控網絡，提示Gsx2通過時空調控機制參與OPCs分化的定時過程。
金伯利·A·阿雷納（Kimberly A. Arena）|克里斯蒂娜·A·科爾恩斯（Christina A. Kearns）|穆罕默德·艾哈邁德（Mohamoud Ahmed）|麗貝卡·奧羅克（Rebecca O’Rourke）|查爾斯·G·薩格斯特倫（Charles G. Sagerstr?m）|桑托斯·J·弗蘭科（Santos J. Franco）|布魯斯·阿佩爾（Bruce Appel）
美國科羅拉多州奧羅拉市科羅拉多大學安舒茨分校（University of Colorado Anschutz）兒科系發育生物學部門，郵編80045
摘要
神經系統的發育依賴于神經前體細胞（NPCs）有序且協調地分化為多種神經元和膠質細胞。在脊髓中，pMN區域的NPCs在發育早期會產生神經元，隨后產生少突膠質細胞前體細胞（OPCs），這些前體細胞會進一步分化為少突膠質細胞（OLs），即中樞神經系統的髓鞘形成細胞。目前尚不清楚哪些機制決定了神經前體細胞會走向少突膠質細胞的分化路徑。我們以斑馬魚為實驗模型，通過單細胞RNA測序和單核ATAC測序技術發現了一類名為pre-OPCs的NPC亞群，這類細胞似乎注定會分化為OPCs。pre-OPCs特異性表達多種編碼少突膠質細胞特異性轉錄因子的基因，其中包括Gsx2，該基因在小鼠前腦中調控OPCs的形成。為研究Gsx2在斑馬魚OPCs分化中的作用，我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術創建了gsx2的功能缺失突變體。gsx2純合突變體胚胎會提前開始OPCs的形成，并產生過多的OPCs，但不會影響OLs的分化。通過我們的單核多組學數據集，我們預測了一個以gsx2為中心的基因調控網絡，并識別出可能受Gsx2轉錄調控的基因。綜合這些研究結果表明，pre-OPCs中的Gsx2表達參與了OPCs分化的時間調控過程。
章節摘錄
引言
在脊椎動物的中樞神經系統中（CNS），軸突被一種富含脂質的特殊膜——髓鞘所包裹，這種膜由稱為少突膠質細胞的膠質細胞產生。髓鞘能夠提高軸突中的電信號傳導速度，并維持神經細胞的健康；因此，少突膠質細胞對脊椎動物的神經系統功能至關重要。要理解功能性神經回路在脊椎動物發育過程中的形成機制，就必須了解少突膠質細胞的生成過程。
結果
pre-OPCs是一類表達gsx2基因的神經前體細胞
在斑馬魚中，pMN前體細胞在受精后大約10至30小時開始產生運動神經元（Myers等人，1986年）（圖1A）。OPCs的分化過程始于受精后約40小時（Scott等人，2021年），隨后在受精后72小時分化為髓鞘形成細胞OLs（Buckley等人，2010年）（圖1A）。在之前的命運追蹤研究中，我們發現了...
討論
盡管許多研究已經揭示了調控少突膠質細胞分化的機制（Emery和Wood，2024年），但我們對決定神經前體細胞走向少突膠質細胞命運的機制仍存在較大認知空白。這一空白主要是由于我們對產生OPCs的具體神經前體細胞及其分化調控基因的了解還不夠全面。通過本研究和之前的研究...
斑馬魚品系與飼養
所有動物實驗均獲得了科羅拉多大學醫學院機構動物護理和使用委員會（IAUCUC）的批準。所有非轉基因胚胎均來自AB品系雄性和雌性的配對雜交。所有轉基因胚胎則來自AB品系雄性或雌性與Tg(olig2:egfp)vu12品系雄性或雌性的配對雜交（Shin等人，2003年）。胚胎在含有6克Instant Ocean的卵水中于28.5°C的培養皿中培養。
免疫組化
幼蟲在指定時間點用4%的PFA固定，室溫下搖動3小時。然后用0.1%的Triton/1x PBS（PBSTx）沖洗，并在4°C下保存。隨后將幼蟲嵌入1.5%的瓊脂/30%蔗糖溶液中過夜處理。冰凍后的組織塊使用冷凍切片機切成15微米的橫截面，并收集在偏振載玻片上。載玻片安裝在Sequenza支架（Ted Pella cat 36105）上，用PBSTx沖洗3次，每次5分鐘，然后用2%的山羊血清/2%的...CRediT作者貢獻聲明
查爾斯·G·薩格斯特倫（Charles G. Sagerstr?m）：撰寫、審稿與編輯、資金申請。麗貝卡·奧羅克（Rebecca O’Rourke）：數據分析。穆罕默德·艾哈邁德（Mohamoud Ahmed）：實驗研究。克里斯蒂娜·A·科爾恩斯（Christina A. Kearns）：實驗研究、數據分析。布魯斯·阿佩爾（Bruce Appel）：撰寫、審稿與編輯、項目管理、資源協調、實驗設計、概念構思。桑托斯·J·弗蘭科（Santos J. Franco）：撰寫、審稿與編輯、資金申請。金伯利·A·阿雷納（Kimberly A. Arena）：初稿撰寫、實驗研究、資金申請、數據分析、概念構思。
關鍵資源表格
| 試劑或資源 | 來源 | 標識符 |
|---|
| 抗體 |
| 抗兔Sox10抗體 | (Park等人，2005) | ZDB-ATB-081226-2 |
| 抗兔Sox2抗體 | Abcam | 97959 |
| 抗鼠Isl1抗體 | DSHB | 39.4-D |
| Alexa Fluor Goat Anti-Mouse 568抗體 | Life Technologies | A11004 |
| Alexa Fluor Goat Anti-Rabbit 568抗體 | Life Technologies | A11011 |
| 化學物質、肽類及重組蛋白 |
|---|
| Protease Bacillus licheniformis | Sigma | P5380 |
| RNAScope Multiplex Fluorescent V2檢測試劑盒 | ACD Bio | 323110 |
| RNAScope Probe-Dr-sox10-Ch-2 | ACD |
致謝
本研究得到了美國國立衛生研究院（NIH）/國家神經疾病與中風研究所（R01 NS124166資助S.J.F.、B.H.A.和C.G.S.；R35 NS122191資助B.H.A.；以及Gates Frontiers基金會對B.H.A.的資助。我們感謝Tyler Gibson博士在生物信息學分析方面提供的技術支持，同時也感謝斑馬魚實驗設施的工作人員在動物護理方面的辛勤工作。此外，還要感謝Kris Russell在建立gsx2突變體基因分型方案方面所做的貢獻。
