在日常生活中，生物體暴露于多種外部因素中，包括光照、溫度和季節(jié)性日照時(shí)間的變化。為了維持穩(wěn)態(tài)并應(yīng)對(duì)這些變化，生物體進(jìn)化出了生物鐘機(jī)制，該機(jī)制通過(guò)產(chǎn)生節(jié)律性周期來(lái)使生理過(guò)程與環(huán)境信號(hào)同步。核心生物鐘蛋白（如BMAL1和CLOCK）形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，驅(qū)動(dòng)下游核心生物鐘基因（包括Per和Cry）的表達(dá)。當(dāng)PER和CRY蛋白積累到一定程度后，會(huì)通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制抑制BMAL1和CLOCK的活性，從而維持24小時(shí)的振蕩周期。此外，核受體REV-ERB和視黃酸相關(guān)孤兒受體A（RORA）進(jìn)一步調(diào)節(jié)生物鐘機(jī)制，其中RORA通過(guò)促進(jìn)Bmal1的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)生物鐘節(jié)律的穩(wěn)定性，而REV-ERB則抑制Bmal1的表達(dá)（Guillaumond等，2005；Partch等，2014；Liu等，2025；Mortimer等，2025）。

斑馬魚(yú)（Danio rerio）的生物鐘機(jī)制已經(jīng)得到充分研究，并在脊椎動(dòng)物中高度保守（Cahill，2002）。由于硬骨魚(yú)類特有的基因組復(fù)制，斑馬魚(yú)擁有豐富的生物鐘基因，包括四個(gè)period基因（per1a、per1b、per2和per3）、七個(gè)cryptochrome基因（cry1a、cry1b、cry2、cry3a、cry3b、cry4和cry5）、三個(gè)bmal基因（bmal1a、bmal1b和bmal2clock基因（clocka和clockb）。這些核心生物鐘基因通過(guò)負(fù)反饋回路調(diào)節(jié)自身的表達(dá)。值得注意的是，在斑馬魚(yú)中，cry1a和per2的表達(dá)可以直接由轉(zhuǎn)錄因子Tef誘導(dǎo)（Sacksteder和Kimmey，2022）。與哺乳動(dòng)物不同，哺乳動(dòng)物產(chǎn)生生物節(jié)律并同步外圍生物鐘的主時(shí)鐘位于下丘腦的視交叉上核（SCN，Weaver，1998），而在斑馬魚(yú)中，這一功能似乎由松果體承擔(dān)（Ben-Moshe等，2014）。然而，在魚(yú)類中，生物鐘系統(tǒng)高度分散，外圍生物鐘可以獨(dú)立響應(yīng)外部信號(hào)產(chǎn)生節(jié)律（Whitmore等，1998；Whitmore等，2000）。

研究表明，生物鐘機(jī)制幾乎存在于所有細(xì)胞中，并影響多種生理過(guò)程，包括微生物群和免疫系統(tǒng)。微生物群對(duì)腸道、胰腺甚至神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育至關(guān)重要（Xia等，2022）。生物鐘與微生物群之間的相互作用是雙向的，日常進(jìn)食模式對(duì)維持微生物群穩(wěn)定性至關(guān)重要（Zhao等，2022），而生物鐘紊亂會(huì)導(dǎo)致微生物群組成的改變（Voigt等，2014）。

在免疫系統(tǒng)中，生物鐘調(diào)節(jié)白細(xì)胞的數(shù)量、循環(huán)和活性（Cermakian等，2013）。例如，它調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞釋放顆粒酶B和穿孔素（Arjona等，2004），免疫受體（如Toll樣受體TLRs）和趨化因子受體的表達(dá)也遵循生物鐘節(jié)律（Zeng等，2024）。此外，在魚(yú)類中，許多免疫相關(guān)過(guò)程也表現(xiàn)出生物鐘節(jié)律性。例如，在斑馬魚(yú)中，中性粒細(xì)胞的數(shù)量在光照中期達(dá)到峰值，而這些細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧在光照后期最高。同樣，參與大腸桿菌吞噬的吞噬細(xì)胞比例在光照后期達(dá)到峰值（Kaplan等，2008）。我們之前的研究表明，核心生物鐘基因和蛋白在鯉魚(yú)的淋巴器官和淋巴相關(guān)組織中也以生物鐘方式表達(dá)，且這種表達(dá)依賴于光照條件（Mazur等，2025；Mazur等，2025）。這些發(fā)現(xiàn)清楚地表明，免疫系統(tǒng)與生物鐘之間的相互作用在魚(yú)類中同樣重要且具有功能性。

我們最近的研究表明，在斑馬魚(yú)感染蒂拉皮亞湖病毒（TiLV）的成年模型中，病毒注射的時(shí)間影響了生物鐘基因和抗病毒基因的表達(dá)以及病毒復(fù)制（Mazur等，2023）。我們還觀察到鯉魚(yú)的淋巴器官和組織中生物鐘基因的持續(xù)表達(dá)，且在不同光照條件下表達(dá)模式會(huì)發(fā)生變化。此外，在感染鯉皰疹病毒3（CyHV-3）和鯉春病毒血癥（SVCV）期間，淋巴組織中的生物鐘基因表達(dá)水平與病毒拷貝數(shù)呈負(fù)相關(guān)（Mazur等，2025a）。

功能喪失研究也證明了生物鐘與免疫系統(tǒng)相互作用的重要性。在斑馬魚(yú)幼體中，clock1a敲除增強(qiáng)了中性粒細(xì)胞向損傷部位的遷移（Chen等，2023），而per1b敲除在炎癥模型中抑制了NF–κB信號(hào)通路（Ren等，2018）。需要強(qiáng)調(diào)的是，包括斑馬魚(yú)在內(nèi)的魚(yú)類的免疫反應(yīng)與哺乳動(dòng)物有許多相似之處。然而，斑馬魚(yú)的適應(yīng)性免疫僅在受精后4-6周開(kāi)始發(fā)育，這意味著早期幼體階段可以專門研究先天免疫反應(yīng)（Novoa和Figueras，2011）。在病毒感染過(guò)程中，多種斑馬魚(yú)細(xì)胞類型（包括吞噬細(xì)胞）通過(guò)病原體識(shí)別受體（如RIG-I樣受體和TLRs）識(shí)別病毒核酸。這種識(shí)別激活信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)I型干擾素（IFNs）和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。I型IFNs以自分泌和旁分泌方式進(jìn)一步刺激抗病毒蛋白（如mxa）的表達(dá)（Langevin等，2013）。斑馬魚(yú)幼體和成體已被證明是研究病毒感染期間宿主-病原體相互作用的寶貴模型（Burgos等，2008；Palha等，2013；Sullivan等，2017）。最近，我們開(kāi)發(fā)了斑馬魚(yú)的TiLV感染模型（Rakus等，2020）。TiLV由Eygnor等（2014）首次鑒定，是一種包膜負(fù)鏈單鏈RNA病毒，主要感染尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus），在水產(chǎn)養(yǎng)殖中導(dǎo)致高死亡率（Bacharach等，2016）。在斑馬魚(yú)中，TiLV感染會(huì)上調(diào)先天免疫基因的表達(dá)，包括rig-I和tlr-22、干擾素調(diào)節(jié)因子（irf3和irf7）、I型干擾素（inf?1）、抗病毒蛋白mxa和促炎細(xì)胞因子il-1β（Rakus等，2020；Mojzesz等，2021；Widziolek等，2021；Mazur等，2023）。

在本研究中，我們旨在探討cry1a和cry1b基因敲除對(duì)斑馬魚(yú)幼體發(fā)育、行為和微生物群組成的影響。此外，我們還評(píng)估了這些敲除對(duì)TiLV感染后抗病毒免疫反應(yīng)和幼體存活的影響。

選擇cry1a和cry1b基因是基于它們作為斑馬魚(yú)生物鐘核心組分的已知作用以及它們強(qiáng)烈的光誘導(dǎo)性。這些基因是光同步的主要介質(zhì)，直接受光激活的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，并且與其他生物鐘基因相比表現(xiàn)出更強(qiáng)的節(jié)律性表達(dá)。重要的是，先前的研究和我們的數(shù)據(jù)表明，cry1a和cry1b不僅影響時(shí)間調(diào)節(jié)，還影響其他生理過(guò)程，包括調(diào)節(jié)抗病毒免疫反應(yīng)。