《Biomaterials》：Cardiac and skeletal muscle delivery of biotherapeutics with a blood vessel epicardial substance-targeting peptide
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靶向遞送系統開發及在杜氏肌營養不良治療中的應用，通過噬菌體展示篩選出肌肉特異性肽BV2，證實其通過 caveolae介導的內吞作用高效遞送PMO、mCherry蛋白及外泌體至骨骼肌和心臟，在mdx和DKO小鼠中顯著恢復肌 dystrophin表達，尤其心臟部位，并驗證了微針遞送系統的有效性。
王標標|曹家慧|吳靜橋|趙一文|張瑤|Frank Abendroth|林超瑞|鐘麗|余華南|Seow Yiqi|歐美彤|Olalla Vázquez|林梅|尹海芳|韓剛
國家實驗血液學重點實驗室、天津市醫學大學醫學表觀遺傳學省部協同創新中心、醫學技術系及細胞生物學系，中國天津市和平區啟翔臺路300070
摘要
盡管基于肽的遞送策略在肌肉和心臟疾病治療中顯示出潛力，但將生物制劑遞送到骨骼肌和心肌仍然具有挑戰性。在這里，我們通過噬菌體展示技術發現了一種能夠靶向血管外膜物質（BVES）的肌肉導向肽（BV2）。BV2對BVES具有高親和力，并主要通過洞穴樣內吞作用被細胞內化。重要的是，BV2能夠有效地將杜氏肌營養不良癥（DMD）磷酸二酰胺寡聚物（PMO）、mCherry蛋白和外泌體遞送到骨骼肌和心臟體內。當將裝載這些生物制劑的微針植入小鼠的后肢時，BV2-mCherry蛋白和BV2-E31R抗肌抑素肽能夠有效地遞送到肌肉層。此外，在移植了BV2-E31R微針的肌肉萎縮小鼠中，肌肉質量和肌纖維大小也顯著增加。當外泌體同時被BV2和PMO修飾時，杜氏肌營養不良癥（mdx）和肌抑素/烏特羅芬雙敲除小鼠的外周肌和心肌中的肌抑素蛋白恢復情況也顯著改善。這些發現突顯了BV2在定向遞送多種生物制劑到肌肉和心臟方面的有效性，從而為DMD及其他肌肉和心臟疾病的治療提供了有效的工具。
引言
肌肉萎縮疾病，如肢帶型肌營養不良癥（LGMD）、骨骼肌萎縮和杜氏肌營養不良癥（DMD），會導致骨骼肌和心肌的喪失1, 2, 3, 4，因此任何治療方法都需要同時針對這兩種肌肉。盡管反義寡核苷酸（AO）介導的外顯子跳躍療法顯示出巨大潛力，已有四種DMD AO藥物在臨床上獲得有條件批準，但肌肉（尤其是心肌）中肌抑素的合成仍然不足，無法實現功能改善6。因此，將AO和其他生物制劑有效地、選擇性地遞送到骨骼肌和心肌是治療DMD及其他肌肉萎縮疾病的關鍵。
肽綴合物的小尺寸、高細胞穿透能力、結構可調性以及相對容易的合成性，使得肽綴合物AO（尤其是細胞穿透肽（CPPs）7, 8, 9受到了廣泛關注。最近，由于低鎂血癥或低劑量下的療效有限（2025年6月公司新聞稿），基于CPP修飾的DMD磷酸二酰胺寡聚物（PMO）AO藥物（包括R6G10（SRP-5051）和Pip5衍生物11, 12（PGN-EDO51）的臨床試驗被終止6, 13），這表明其組織特異性窗口較窄，是一個安全問題。這些臨床結果強調了將核酸制劑安全、選擇性地遞送到骨骼肌和心肌的重要性。相比之下，組織導向肽具有較高的組織選擇性，且與脫靶遞送相關的安全問題較少，代表了一種有吸引力的遞送方式14。多個研究團隊通過噬菌體展示技術在體外15, 16, 17或體內18, 19, 20篩選出了肌肉導向肽。雖然已有報道表明肌肉導向肽能夠定向遞送到骨骼肌15, 20或心肌19，但同時實現向心肌和骨骼肌的選擇性遞送仍是一個關鍵挑戰。
在這里，我們發現了一種通過噬菌體展示技術針對血管外膜物質（BVES）的細胞外域（也稱為Popeye結構域包含蛋白1（POPDC1）篩選得到的肌肉導向肽（BV2），這是一種在心臟和骨骼肌中高表達的三跨膜蛋白21，它能夠實現DMD靶向的PMO、蛋白和外泌體在體內向心肌和骨骼肌的特異性遞送，并主要通過洞穴樣內吞作用被細胞內化。重要的是，當將經過BV2和DMD PMO修飾的外泌體（EXOBV2&PMO）通過靜脈注射給肌抑素缺乏的mdx小鼠和肌抑素/烏特羅芬雙敲除（DKO）小鼠時，沒有觀察到任何毒性，外周肌肉和心臟中的肌抑素蛋白得到恢復，三頭肌中的肌抑素蛋白含量增加了多達10倍。此外，當將BV2-mCherry蛋白或載有BV2和HA的微針植入野生型小鼠或肌肉萎縮小鼠的皮膚時，也促進了蛋白質或治療肽向肌肉層的遞送。我們的研究表明，BV2能夠實現多種生物制劑向心肌和骨骼肌的特異性遞送和細胞內化，為DMD及其他涉及心肌和骨骼肌的疾病提供了新的、有效的肌肉導向遞送工具。
實驗部分
BV2在體外和體內顯示出肌肉導向和細胞內化能力
為了實現生物制劑向心肌和骨骼肌的最佳遞送，我們以BVES的N端細胞外域（1-40個氨基酸）作為靶蛋白。BVES是一種主要在心臟和周圍肌肉中表達的膜定位蛋白23, 24，這一點通過RNA和蛋白質表達分析得到了證實（圖S1A和S1B）。經過兩輪針對12聚體M13噬菌體展示文庫的體外生物淘選后，第二輪篩選到的噬菌體數量明顯多于第一輪
討論
目前臨床上可用的DMD治療方法未能有效恢復心臟中的肌抑素蛋白，而這正是DMD患者早逝的主要原因之一38。特別是，由于有效的骨骼肌限制療法，DMD患者的工作負擔增加會進一步加重心臟疾病的進展6, 40。因此，將AO和其他生物制劑有效地、選擇性地遞送到骨骼肌和心臟至關重要
動物和注射
成年肌抑素缺乏的mdx小鼠和烏特羅芬/肌抑素雙敲除（DKO）小鼠（5-6周齡）購自美國杰克遜實驗室（The Jackson Laboratory），同齡的野生型C57BL/6小鼠購自北京維塔河實驗室動物技術有限公司（北京，中國）。所有動物實驗均按照天津醫科大學動物實驗單元的程序進行，并得到了機構倫理委員會的批準（許可CRediT作者貢獻聲明
張瑤：研究工作。趙一文：研究工作。吳靜橋：研究工作。韓剛：撰寫初稿、驗證、方法學設計、研究實施、資金獲取、數據分析、概念構思。曹家慧：研究工作。林梅：資源協調。鐘麗：研究工作。林超瑞：資源協調。Frank Abendroth：資源協調。尹海芳：撰寫初稿、資金獲取、數據分析、概念構思。Olalla Vázquez：資源協調。利益沖突聲明
? 作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文所述工作的財務利益或個人關系。
致謝
作者感謝俄勒岡州立大學（Corvallis, OR, USA）的Hong M Moulton教授提供EXP-PMO，以及阿爾伯塔大學（Edmonton, AB, Canada）的Yokota Toshifumi教授對修訂后的手稿進行的關鍵審閱。本研究得到了國家自然科學基金（項目編號：82320108013, 82571599）、天津市自然科學基金（項目編號：22JCYBJC00010, 22JCZXJC00020）、天津“一帶一路”聯合實驗室項目（項目編號：24PTLYHZ00330）以及“公開競賽”的資助
