《Biotechnology Journal》：A Growth-Coupled Evolutionary Strategy Enhances Heme Biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae
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本研究創新性地將生長加速靶向進化（GATE）平臺應用于釀酒酵母，通過構建血紅素響應性CYC1啟動子驅動生長促進基因PTH1的表達回路，經100小時連續培養與質粒消除，成功篩選出非轉基因突變株Evol-GATE。該突變株胞內血紅素含量提升約6.5倍，且全基因組測序證實無外源質粒殘留，為開發高血紅素強化型單細胞蛋白（SCP）及下一代人造肉提供了安全高效的菌株選育策略。
1 引言
鐵作為人體必需微量元素，以血紅素和非血紅素形式被吸收，其中血紅素鐵因受膳食抑制劑影響小且生物利用度高而更具營養優勢。傳統肉類通過血紅蛋白和肌紅蛋白提供豐富血紅素來源，但畜牧業面臨的環境與資源壓力促使人們探索微生物單細胞蛋白（SCP）等可持續替代方案。釀酒酵母因其高蛋白含量、均衡氨基酸組成及公認安全（GRAS） status被廣泛關注，然而其天然血紅素含量較低，限制了其在模擬肉類風味和鐵營養強化方面的應用。近年來，代謝工程與進化策略已被用于提升微生物宿主（如酵母）的血紅素產量，但多數方法依賴遺傳修飾。本研究旨在通過生長加速靶向進化（GATE）策略，在釀酒酵母中建立血紅素合成與細胞增殖的自我強化回路，最終獲得非轉基因的高血紅素生產菌株。
2 材料與方法
2.1 菌株與培養基
以釀酒酵母BY4742為親本型（PT），使用合成限定（SD）培養基和YPD復合培養基進行培養。
2.2 質粒構建
以pRS327為載體骨架，通過Gibson組裝將血紅素敏感型CYC1啟動子與生長促進基因PTH1連接，構建表達盒（圖1），并通過LiAc/PEG法轉化酵母。
2.3 培養條件
分批培養在500 mL擋板瓶中進行，5 L發酵罐實驗控制溶氧100%、pH 5.6。
2.4 適應性進化連續培養
在最小培養基中建立連續培養系統，維持恒定培養體積并通過逐步提高進料速率施加選擇壓力。
2.5 質粒消除
通過PEG3350處理及賴氨酸缺陷型培養基篩選，獲得質粒消除突變株。
2.6 血紅素測定
采用丙酮-HCl法提取總血紅素與蛋白結合血紅素，通過HPLC（C18柱，檢測波長398 nm）定量。
2.7 ROS檢測
使用DCFH-DA探針測量細胞內活性氧（ROS）水平，熒光強度歸一化至OD600。
2.8 轉錄組分析
通過3′ mRNA-Seq（Illumina NextSeq 2000）檢測基因表達，差異表達分析基于TMM+CPM標準化。
2.9 全基因組測序（WGS）
使用Illumina Novaseq X平臺進行雙端測序，變異調用通過GATK HaplotypeCaller完成，參考基因組為S288C。
3 結果與討論
3.1 血紅素響應性GATE回路設計
通過將HAP1轉錄因子結合的血紅素敏感型CYC1啟動子與核糖體翻譯關鍵因子PTH1耦合，建立正反饋回路：血紅素水平升高激活HAP1，驅動PTH1表達促進增殖，進而強化血紅素蛋白合成（圖1）。補充5-ALA可誘導該回路初步激活（圖S1）。
3.2 適應性進化富集高產血紅素菌株
在最小培養基中連續培養300小時，GATE組在100小時時血紅素含量達峰值，隨后逐漸回落（圖2），表明長期進化可能導致代謝負擔減輕的表型逆轉。因此選擇100小時樣本進行質粒消除，獲得Evol-control與Evol-GATE菌株。
3.3 生物量與血紅素積累譜
在復合培養基中，Evol-GATE的最大生物量顯著低于PT，但血紅素含量提高約5倍（1.5 mg/L），且5 L發酵罐中進一步提升至6.5倍（圖3，圖S4）。復合培養基的豐富前體更利于GATE策略展現血紅素合成優勢。
3.4 游離血紅素誘導氧化應激與凋亡
Evol-GATE中游離血紅素占比約20%（0.3 mg/L），導致ROS水平升高6倍（圖3E）。凋亡相關基因（YCA1、DNM1、AIF1、NUC1、NMA111）mRNA顯著上調（圖4A），表明游離血紅素過載引發氧化損傷與程序性死亡，解釋其生長受限現象。
3.5 血紅素穩態的轉錄重編程
Evol-GATE中血紅素降解酶基因HMX1、輸出蛋白基因PUG1及調控因子ROX1表達上調，但未能逆轉血紅素積累（圖4A）。核心血紅素合成通路基因（HEM3、HEM4、HEM13等）協同上調（圖4B），而Evol-control僅個別基因變化且HEM4顯著抑制，說明GATE特異性驅動通路整體激活。
3.6 WGS驗證非轉基因狀態與突變特征
WGS顯示Evol-GATE核基因組覆蓋度>99.9%，pRS327同源區域僅部分匹配，無完整質粒整合（表S3）。與Evol-control相比，Evol-GATE特異性變異僅22個（表1），涉及鐵穩態（BOL2）、染色質調控（RSC30）等基因，但核心血紅素合成與調控基因無突變，表明表型由轉錄重編程而非關鍵突變主導。
4 結論
GATE策略通過血紅素響應性生長耦合回路，成功選育出血紅素產量顯著提升且無外源基因整合的釀酒酵母突變株。轉錄組與基因組分析證實其代謝通路重構與非轉基因特性，為開發血紅素強化型SCP提供了安全高效的菌株開發平臺。
