黑色素瘤是最具侵襲性的皮膚癌類型之一，其遺傳異質性導致預后不良和頻繁復發[1]。盡管癌癥治療在控制腫瘤生長和延長患者生存方面取得了一些進展[2,3]，但傳統治療方法往往受到脫靶效應和顯著毒性的困擾，從而嚴重影響患者的生活質量[4,5,6]。這些挑戰凸顯了需要創新的治療策略，以精確靶向驅動黑色素瘤的致癌基因，以改善臨床結果和患者福祉。
斑馬魚模型被認為是黑色素瘤研究和藥物評估中最合適的動物模型之一，因為它在關鍵癌癥相關信號通路方面與人類高度保守[7,8,9]。大約70%的人類致癌基因在斑馬魚中有同源對應物，使得腫瘤發展的分子機制高度相似[10]。此外，斑馬魚對異種移植的人類黑色素瘤細胞具有很強的免疫耐受性[11]，這有助于準確模擬腫瘤微環境和藥物反應，對于評估抗腫瘤藥物的效果非常有價值[7]。值得注意的是，斑馬魚的腫瘤異種移植模型為預測各種類型癌癥的個性化治療策略提供了平臺[12,13]。當與黑色素瘤細胞和斑馬魚異種移植模型結合使用時，可以加速納米藥物的臨床前開發，同時降低研發成本[14,15,16]。
近年來，基因編輯通過實現對驅動腫瘤生長和轉移的致癌基因的精確修飾，徹底改變了癌癥治療方式，相比缺乏特異性的傳統化療具有優勢[17,18,19]。在各種工具中，CRISPR/Cas系統因其能夠選擇性改變基因組、轉錄組和表觀基因組而受到重視[20,21,22,23]。CRISPR/Cas9利用單導向RNA（sgRNA）引導的Cas9核酸酶誘導位點特異性的DNA雙鏈斷裂（DSBs），從而實現靶向基因破壞或校正[24,25]。然而，盡管其具有治療潛力，但由于Cas9蛋白和sgRNA是大分子，需要高效且安全地輸送到癌細胞中才能實現有效的基因編輯效果，因此臨床應用受到限制。病毒載體已被探索用于輸送CRISPR/Cas組分；然而，它們存在多種局限性，包括免疫原性、包裝能力有限以及持續的Cas9表達，這增加了脫靶效應的風險[26,27]。非病毒輸送系統，特別是脂質納米顆粒（LNPs），作為一種有前景的替代方案，已在COVID-19大流行期間成功應用于mRNA疫苗的輸送[28,29]。LNPs通常由四種關鍵成分組成：可電離脂質、膽固醇、輔助脂質和聚乙二醇化脂質[30,31]。這些結構具有高載荷封裝效率、生物相容性和可擴展制造等優點。然而，LNPs的系統給藥往往會導致其在非靶組織（尤其是肝臟）中的積累，限制了其對腫瘤部位的有效輸送[32]。為了克服這些挑戰，人們投入了大量努力來設計具有腫瘤靶向能力的LNPs[33,34]。使用靶向LNPs不僅解決了輸送大分子基因編輯載荷的關鍵問題，還減少了脫靶效應，提供了更精確的治療方法[35,36]。
一種有前景的方法是使用靶向配體，如肽，將其連接到LNPs表面以提高腫瘤特異性。肽作為靶向分子具有吸引力，因為它們分子量小、易于合成、穩定性高，并且對腫瘤細胞上過度表達的特定受體具有強親和力[37,38]。這些特性使肽能夠實現精確的腫瘤靶向，同時保持低毒性和高生物相容性，使其成為開發靶向藥物輸送系統的理想候選者[39,40,41]。CD44是一種參與細胞間相互作用、粘附和遷移的跨膜糖蛋白，在黑色素瘤中經常過度表達[1,42]。它通過促進上皮-間充質轉化（EMT）、增強轉移潛能和維持癌干細胞樣表型來促進腫瘤進展[43,44]。由于在黑色素瘤細胞中的高表達，CD44成為治療應用中的理想靶向分子[45,46,47]。值得注意的是，A6肽已被證明能有效結合過度表達CD44的腫瘤，包括黑色素瘤，為靶向輸送提供了一個有前景的平臺[45,48,49]。
在這項研究中，我們報道了開發了用于靶向輸送CRISPR/Cas9組分到皮膚黑色素瘤細胞的肽修飾脂質納米顆粒（LNPs）。具體來說，我們使用CD44靶向肽A6來功能化LNPs，以提高其對黑色素瘤的腫瘤特異性。這些功能化的LNPs裝載了CRISPR/Cas9組分，包括Cas9 mRNA和針對polo樣激酶1（PLK1）的單導向RNA（sgRNA），PLK1是細胞周期進展的關鍵調節因子和已知的致癌靶點[50,51]。通過將CD44靶向肽納入LNP結構，我們在過度表達CD44的黑色素瘤細胞中實現了顯著的細胞攝取和基因編輯效率提升。我們的體外和體內結果表明，PLK1表達受到顯著抑制，從而有效抑制了黑色素瘤的生長并增強了抗腫瘤效果。這項工作突顯了肽修飾LNPs作為高度特異性和有效的癌癥治療基因編輯輸送平臺的潛力。通過結合CRISPR/Cas9技術的精確性和肽修飾LNPs的靶向能力，我們提供了一種多功能策略，以提高基因治療的效果和特異性。此外，這種輸送系統在需要靶向基因組編輯方法的其他疾病治療中也具有廣泛的應用前景。
