揭示單細胞數(shù)據(jù)中潛在的細胞狀態(tài)景觀需要克服批次整合、降噪和降維等關(guān)鍵障礙。CONCORD作為一個統(tǒng)一框架，通過概率采樣策略（數(shù)據(jù)集感知采樣和困難負采樣）與簡約的對比學(xué)習(xí)模型，在自監(jiān)督學(xué)習(xí)框架內(nèi)同時應(yīng)對這些挑戰(zhàn)。該方法僅使用單隱藏層的 minimalist 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，無需依賴深度架構(gòu)、輔助損失或外部監(jiān)督，即可超越現(xiàn)有技術(shù)性能。CONCORD能夠無縫整合跨批次、技術(shù)甚至物種的數(shù)據(jù)，生成高分辨率細胞圖譜。其生成的潛在表示是去噪且具有生物學(xué)意義的，能夠捕捉基因共表達程序、揭示詳細譜系軌跡，并保留局部幾何關(guān)系和全局拓撲結(jié)構(gòu)。

單細胞測序數(shù)據(jù)分析表明，基因表達受到基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細胞間相互作用的約束，從而在高維基因表達空間中形成結(jié)構(gòu)化的低維“狀態(tài)景觀”。CONCORD通過重新設(shè)計對比學(xué)習(xí)中的小批量（minibatch）采樣策略，將對比學(xué)習(xí)對minibatch組成的敏感性轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢。其核心是聯(lián)合概率采樣框架，結(jié)合了困難負采樣（hard-negative sampling）和數(shù)據(jù)集感知采樣（dataset-aware sampling）。

困難負采樣通過在小批量中富集密切相關(guān)（即困難負樣本）的細胞，迫使模型學(xué)習(xí)區(qū)分密切相關(guān)的細胞狀態(tài)。CONCORD實現(xiàn)了兩種變體：基于k近鄰（kNN）的采樣器和hcl模式。kNN采樣器根據(jù)細胞狀態(tài)景觀的粗略圖近似，概率性地從局部鄰域和全局分布中抽取細胞，使模型能夠同時捕捉大規(guī)模區(qū)別和局部細節(jié)。hcl模式則通過蒙特卡洛重要性采樣來近似困難負采樣的預(yù)期損失。

數(shù)據(jù)集感知采樣通過將每個小批量限制主要來自單個數(shù)據(jù)集的細胞，確保對比反映的是生物學(xué)差異而非技術(shù)差異。數(shù)據(jù)集特定的偏差通過隨機小批量洗牌進一步減弱，使得只有有生物學(xué)意義的信號（如基因共表達模式）在訓(xùn)練中持續(xù)存在。

這兩種采樣器被整合到一個統(tǒng)一的聯(lián)合采樣框架中，其核心原則是概率性地構(gòu)建小批量，以平衡全局生物多樣性與局部和數(shù)據(jù)集特定的變異。這種簡單的創(chuàng)新使CONCORD僅使用具有單隱藏層的 minimalist 編碼器就超越了現(xiàn)有技術(shù)性能，表明采樣設(shè)計本身可以改變對比學(xué)習(xí)在單細胞數(shù)據(jù)上的性能。

為了評估CONCORD在保留基因表達空間的幾何和拓撲結(jié)構(gòu)方面的性能，研究團隊在模擬數(shù)據(jù)集上進行了基準(zhǔn)測試。他們開發(fā)了一個定制的工作流程來創(chuàng)建具有復(fù)雜生物結(jié)構(gòu)（如分支或環(huán)）的真實模擬數(shù)據(jù)。

評估管道包括幾何指標(biāo)（如可信度trustworthiness和全局距離相關(guān)性）以及基于持續(xù)同調(diào)（persistent homology）和貝蒂數(shù)（Betti numbers）的拓撲數(shù)據(jù)分析（TDA）。在簡單的三簇模擬中，CONCORD清晰地分離了簇，而許多其他方法未能完全解析簇或引入了虛假結(jié)構(gòu)。持續(xù)同調(diào)分析證實，CONCORD的貝蒂-0平臺準(zhǔn)確地反映了預(yù)期的三簇拓撲結(jié)構(gòu)。

在具有三個環(huán)和多個分支點的更復(fù)雜模擬中，CONCORD忠實地恢復(fù)了完整的拓撲結(jié)構(gòu)，而其他方法要么扭曲了結(jié)構(gòu)，要么在貝蒂分析中未能檢測到正確數(shù)量的環(huán)。定量評估證實，CONCORD在幾何和拓撲指標(biāo)上始終優(yōu)于競爭方法，并在廣泛的鄰域大小范圍內(nèi)保持高可信度。

在模擬分層分支樹以評估困難負采樣的影響時，沒有困難負采樣時，子分支無法解析。適度富集困難負樣本顯著提高了兩種CONCORD變體的分辨率。

批次效應(yīng)通常表現(xiàn)為數(shù)據(jù)集特定的全局信號，可能掩蓋生物變異。在CONCORD中，當(dāng)小批量被限制在單個數(shù)據(jù)集時，這些信號在訓(xùn)練過程中迅速減弱。與依賴顯式對齊模型的傳統(tǒng)批次校正方法不同，CONCORD對批次效應(yīng)的來源或形式做出最小假設(shè)，而是優(yōu)先學(xué)習(xí)連貫的、有生物學(xué)意義的基因共變異模式。

在具有噪聲、批次效應(yīng)和批次大小不平衡的五簇模擬數(shù)據(jù)集上，CONCORD是唯一能穩(wěn)健恢復(fù)所有五個簇的方法。在涉及跨不同條件采樣的連續(xù)狀態(tài)轉(zhuǎn)換的更具挑戰(zhàn)性的場景中（例如軌跡、環(huán)和樹，且狀態(tài)重疊程度不同），許多競爭方法表現(xiàn)出較差的對齊效果并引入了人工結(jié)構(gòu)。相比之下，兩種CONCORD變體始終恢復(fù)了正確的拓撲結(jié)構(gòu)并降低了噪聲，即使批次間的重疊最小。

在具有16種不同批次效應(yīng)的軌跡模擬中，CONCORD（尤其是kNN變體）實現(xiàn)了卓越的對齊和降噪效果。定量指標(biāo)證實，CONCORD保留了局部幾何結(jié)構(gòu)，同時表現(xiàn)出較低的全局距離相關(guān)性。魯棒性測試表明，當(dāng)僅在少量隨機選擇的批次上訓(xùn)練模型并用于預(yù)測剩余批次時，CONCORD保持了強大的對齊能力，而scVI的性能顯著下降。這表明CONCORD的魯棒性源于學(xué)習(xí)基因共表達程序，而非顯式建模和校正批次效應(yīng)。

在所有模擬中，CONCORD實現(xiàn)了高生物標(biāo)簽保真度，但批次校正分?jǐn)?shù)略低，因為它不顯式合并批次。相比之下，scVI雖然實現(xiàn)了高批次混合分?jǐn)?shù)，但經(jīng)常產(chǎn)生過度混合的嵌入，掩蓋了底層結(jié)構(gòu)。CONCORD在拓撲保存、生物標(biāo)簽保真度和整體性能方面始終名列前茅。

為了評估CONCORD是否捕捉有生物學(xué)意義的結(jié)構(gòu)，研究團隊在秀麗隱桿線蟲（C. elegans）胚胎發(fā)生數(shù)據(jù)集上對其進行了基準(zhǔn)測試，這是一個具有近乎不變的譜系樹的特征明確的系統(tǒng)。

當(dāng)應(yīng)用于結(jié)合了跨物種數(shù)據(jù)集（C. elegans和 C. briggsae）以及新的早期胚胎收集數(shù)據(jù)的大規(guī)模數(shù)據(jù)集（超過41萬個細胞）時，CONCORD生成了一個統(tǒng)一的發(fā)育圖譜，與專家注釋密切匹配，實現(xiàn)了跨物種對齊并以超高分辨率解析了譜系。將譜系樹投影到CONCORD的嵌入上，揭示了與已建立的譜系和命運關(guān)系的強一致性。例如，源自AB祖細胞的ASE、ASJ和AUA神經(jīng)元形成了分支軌跡，反映了其真實的譜系結(jié)構(gòu)。值得注意的是，CONCORD的潛在空間甚至解析了ASE-left和ASE-right神經(jīng)元，這些神經(jīng)元在鹽感應(yīng)反應(yīng)中表現(xiàn)出功能不對稱性。

為了系統(tǒng)評估潛在空間中譜系結(jié)構(gòu)的保存情況，研究評估了隨機選擇的k近鄰鄰域內(nèi)的譜系純度（lineage purity）和平均譜系距離（average lineage distance）。CONCORD即使在大k值下也保持了高譜系純度，并且來自不同譜系的相鄰細胞通常是近親，這反映在較低的平均譜系距離上。相比之下，其他方法產(chǎn)生的嵌入具有明顯更多的混合譜系鄰域。

除了神經(jīng)元發(fā)育中的命運分叉外，來自不同譜系的命運匯聚也是線蟲器官發(fā)生中的常見模式。在肌肉形成中，CONCORD準(zhǔn)確解析了MS、C和D譜系如何匯聚成體壁肌的明確定義的分支，以及罕見匯聚事件。咽部發(fā)育（涉及AB來源和MS來源細胞的復(fù)雜分支和匯聚）同樣被CONCORD詳細解析。

最后，為了測試模型泛化能力，研究在C. elegans批次子集上訓(xùn)練CONCORD和scVI，并將其投影到未見過的C. elegans和所有C. briggsae數(shù)據(jù)上。CONCORD成功整合了保留的批次，對齊了兩個物種，并解析了大多數(shù)細胞類型。相比之下，scVI產(chǎn)生的投影質(zhì)量明顯較低，跨物種對齊差且細胞類型分辨率降低。

與線蟲不同，哺乳動物發(fā)育涉及廣泛的增殖與持續(xù)分化相結(jié)合。為了評估CONCORD能否解析這些交織的過程，研究將其應(yīng)用于小鼠胚胎腸道發(fā)育的單細胞圖譜，該圖譜跨越多個發(fā)育階段、批次、空間片段和富集的細胞群體，由于批次覆蓋不完整，構(gòu)成了一個具有挑戰(zhàn)性的整合任務(wù)。

CONCORD有效整合了數(shù)據(jù)，并在不同細胞類型中解析了細粒度的子結(jié)構(gòu)。在腸道上皮細胞中，CONCORD不僅解析了罕見亞型（如腸內(nèi)分泌細胞），還揭示了兩條平行軌跡——每條都包含一個細胞周期環(huán)和一個分化路徑——對應(yīng)于空間不同區(qū)域的干細胞增殖和分化。這些結(jié)構(gòu)未被其他方法捕捉，并得到成年分區(qū)標(biāo)記物（如Bex4和Onecut2）的支持，表明CONCORD可以在胚胎期第13.5天就檢測到上皮分區(qū)。

在腸道神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）中，CONCORD捕捉了Sox10⁺⁺祖細胞的細胞周期，并識別了由Etv1和Bnc2標(biāo)記的神經(jīng)元發(fā)育的兩個不同分支，與之前的觀察結(jié)果一致。這些分支似乎通過共享的在兩個分支晚期廣泛活躍的神經(jīng)元成熟基因的表達而匯聚。

在間充質(zhì)細胞（構(gòu)成該數(shù)據(jù)集的主要部分）中，CONCORD揭示了Pdgfra^?和平滑肌群體內(nèi)的廣泛異質(zhì)性。這包括四個連續(xù)的細胞周期環(huán)，分別由Ebf1、Slit2、Kit和Acta2的表達標(biāo)記，環(huán)之間存在逐漸過渡。

與Seurat和scVI不同（它們留下許多潛在維度未充分利用），CONCORD產(chǎn)生了一個密集且可解釋的潛在空間，反映了豐富的生物結(jié)構(gòu)并充分利用了其表示能力。每個潛在維度通常封裝多個基因共表達程序，可以通過基于梯度的歸因方法在單細胞或細胞狀態(tài)分辨率上進行解釋。例如，潛在神經(jīng)元Z₄₆在上皮細胞和ENS細胞中都被激活，但歸因分析顯示，其驅(qū)動因素取決于細胞上下文：在上皮細胞中與杯狀細胞特異性基因（富集于糖基化通路）相關(guān)，而在ENS細胞中則反映晚期神經(jīng)元中表達的神經(jīng)元成熟基因。

CONCORD的領(lǐng)域無關(guān)設(shè)計使其能夠應(yīng)用于scRNA-seq以外的多種數(shù)據(jù)模態(tài)。研究團隊在一個具有挑戰(zhàn)性的單細胞ATAC-seq（scATAC-seq）基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集上進行了測試，該數(shù)據(jù)集包含來自兩個供體的外周血單核細胞（PBMC），在八種不同技術(shù)平臺上進行了分析。在定量指標(biāo)和嵌入視覺檢查方面，CONCORD比包括原始研究中基于Harmony的分析在內(nèi)的其他方法產(chǎn)生了更好的批次校正和生物標(biāo)簽保真度。

CONCORD的嵌入揭示了原始注釋中不存在的細粒度免疫亞型。通過使用配對的scRNA-seq和scMultiome數(shù)據(jù)細化細胞類型標(biāo)簽，并將其通過共享的scMultiome細胞投影回scATAC-seq嵌入進行驗證，精煉后的簇（例如，初始和記憶B細胞）與CONCORD在scATAC-seq中發(fā)現(xiàn)的簇精確對應(yīng)。此驗證還發(fā)現(xiàn)了原始研究中的一處錯誤注釋。

當(dāng)應(yīng)用于通過Xenium、3′和5′ scRNA-seq以及固定RNA分析技術(shù)分析的乳腺癌腫瘤微環(huán)境樣本時（僅共享307個基因），CONCORD（hcl模式）相比其他方法實現(xiàn)了顯著更好的整合和細胞類型分辨率。原始研究的一個關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是兩種DCIS（導(dǎo)管原位癌）亞型表現(xiàn)出不同的相鄰微環(huán)境；值得注意的是，在沒有空間坐標(biāo)的情況下，CONCORD通過揭示DCIS和肌上皮簇之間的差異連接性重現(xiàn)了這些相鄰模式。

最后，研究在由單細胞分析開放問題（Open Problems）計劃策劃的六個額外的scRNA-seq數(shù)據(jù)集上對CONCORD進行了基準(zhǔn)測試，包括Tabula Sapiens（超過100萬個細胞）。CONCORD在這些數(shù)據(jù)集上始終取得頂級性能，同時運行速度顯著更快，且內(nèi)存/顯存需求適中。相比之下，幾種方法（包括LIGER、Scanorama和Seurat）由于資源需求過高或違反方法假設(shè)而無法在圖譜尺度上運行。

小批量梯度下降支撐著現(xiàn)代機器學(xué)習(xí)。越來越多的證據(jù)表明，這些小批量的組成會影響模型性能。在對比學(xué)習(xí)中，這種效應(yīng)被放大。CONCORD的核心創(chuàng)新在于通過重新思考小批量如何構(gòu)建，將對比學(xué)習(xí)對minibatch組成的敏感性轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢。

CONCORD的核心是一個統(tǒng)一的概率采樣器，集成了困難負采樣和數(shù)據(jù)集感知采樣。困難負采樣顯著增強了對比模型的表示能力，使其能夠捕捉區(qū)分密切相關(guān)的細胞狀態(tài)的復(fù)雜基因共表達程序。數(shù)據(jù)集感知采樣器用來自單個數(shù)據(jù)集的細胞豐富每個小批量，使模型能夠?qū)W習(xí)生物變異而不糾纏批次效應(yīng)。與依賴匹配簇或顯式批次效應(yīng)模型的傳統(tǒng)方法不同，CONCORD僅通過原則性采樣和訓(xùn)練來減輕批次效應(yīng)。

CONCORD使用 minimalist 編碼器架構(gòu)實現(xiàn)了最先進的性能，表明僅通過合理的采樣和訓(xùn)練即可實現(xiàn)顯著增益，而無需依賴深度架構(gòu)、復(fù)雜目標(biāo)或監(jiān)督。跨不同尺度和模態(tài)的模擬和真實數(shù)據(jù)集，CONCORD始終學(xué)習(xí)去噪、可解釋且拓撲忠實的潛在空間。

CONCORD具有速度優(yōu)化、內(nèi)存高效的設(shè)計。其速度優(yōu)化的向量化采樣算法、原生稀疏矩陣支持和核外數(shù)據(jù)加載使其能夠輕松分析可能超過可用系統(tǒng)內(nèi)存的百萬細胞圖譜。雖然當(dāng)前實現(xiàn)強調(diào)簡單性，但該框架完全可以擴展到更復(fù)雜的架構(gòu)。

除了核心對比編碼器，CONCORD支持可選的解碼器和分類器模塊，用于基因級批次校正、標(biāo)簽傳遞和注釋引導(dǎo)的表示學(xué)習(xí)。此外，批次對齊、信息豐富的潛在空間可以很容易地被成熟的下游方法利用。

當(dāng)基因共表達結(jié)構(gòu)被批次效應(yīng)嚴(yán)重扭曲時，CONCORD的性能可能會受到影響。例如，在單核和全細胞scRNA-seq數(shù)據(jù)之間觀察到次優(yōu)對齊，可能反映了由轉(zhuǎn)錄本定位引起的基因協(xié)方差結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)差異。類似地，特征選擇策略和輸入的生物背景會影響對齊結(jié)果。

重要的是，CONCORD背后的原理并不局限于單細胞測序。解耦技術(shù)偽影與有意義的生物異質(zhì)性的基本挑戰(zhàn)是許多高維數(shù)據(jù)模態(tài)共有的。因此，本文提出的聯(lián)合數(shù)據(jù)集感知和困難負采樣框架為從多樣化和復(fù)雜的生物數(shù)據(jù)集中學(xué)習(xí)魯棒表示提供了一個強大且可推廣的策略，為跨實驗和技術(shù)的更深入、集成的分析鋪平了道路。