《Nature Biotechnology》：CRISPR–Cas3-based editing for targeted deletions in a mouse model of transthyretin amyloidosis
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本研究針對遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性病（ATTR）現有療法無法根治遺傳缺陷的難題，開發了基于CRISPR-Cas3系統的體內基因編輯療法。研究人員通過脂質納米顆粒遞送Cas3 mRNA和crRNA，在小鼠模型中實現了48.7%的肝臟編輯效率，使血清TTR水平降低80.1%，且有效避免了Cas9常見的可讀框內突變風險。該研究為ATTR及其他遺傳性疾病提供了新的治療思路。
轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性病（ATTR）是一種由轉甲狀腺素蛋白（TTR）錯誤折疊形成淀粉樣纖維沉積導致的系統性蛋白質構象疾病。這種疾病主要分為遺傳型（ATTRv）和野生型（ATTRwt）兩種形式，其中遺傳型由TTR基因突變引起，而野生型則與年齡增長相關。據統計，全球約有50萬ATTRwt患者，在80歲以上老年人的尸檢中發現約25%的心臟存在TTR沉積。
目前ATTR的治療方法主要包括TTR穩定劑和核酸類藥物。TTR穩定劑通過阻止TTR四聚體解離和聚集來發揮作用，而小干擾RNA和反義寡核苷酸等核酸類藥物則能降低肝臟中TTR的合成。雖然這些治療方法能夠有效降低循環中的TTR水平并延緩疾病進展，但它們都無法糾正潛在的遺傳缺陷，且通常需要患者終身定期接受治療。
近年來，基于CRISPR-Cas9的基因組編輯策略已進入臨床開發階段。NTLA-2001作為一種脂質納米顆粒遞送的mRNA-Cas9療法，在遺傳性ATTR患者中顯示出持久的血清TTR降低效果，目前已完成3期臨床試驗。長期隨訪數據顯示，NTLA-2001能在24個月內維持高達90%的血漿TTR降低率，展現了體內CRISPR療法的臨床前景。
然而，Cas9編輯通過引入雙鏈斷裂并經由非同源末端連接（NHEJ）修復，通常會產生小的插入或缺失（indels），有時也會出現罕見的大片段缺失或染色體重排。根據indel的模式，閱讀框可能被保留，從而產生可讀框內突變（IFMs），這些突變可能產生異常的蛋白質產物。這一局限性促使研究人員探索其他CRISPR系統。
CRISPR-Cas3作為一類1型I-E系統，其特點是含有多亞基Cascade復合物（Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas11和CRISPR RNA（crRNA）），能夠識別目標DNA并招募Cas3解旋酶-核酸酶，實現進行性和單向的DNA降解。這與Cas9等2類系統引入的局部雙鏈斷裂形成鮮明對比。Cas3通常會在原間隔序列鄰近基序（PAM）上游產生長片段缺失，這一特性可能降低產生保留殘余基因功能的可讀框內突變的可能性。
在這項發表于《Nature Biotechnology》的研究中，研究人員系統評估了CRISPR-Cas3系統對TTR基因的基因組編輯效果。他們通過質粒和mRNA-LNP兩種遞送方式，在小鼠Hepa1-6細胞、體內小鼠肝臟和人HepG2細胞中檢驗了Cas3的編輯效率和特異性。此外，研究人員還利用短讀長和長讀長全基因組測序技術全面分析了脫靶效應，并在TTR外顯子人源化小鼠中分析了體內效應，包括血清TTR降低和心臟沉積情況。
研究人員主要采用了以下幾種關鍵技術方法：首先通過CRISPR RNA優化篩選出高效crRNA；利用脂質納米顆粒（LNP）進行體內遞送；采用全基因組測序（包括短讀長和長讀長技術）全面評估脫靶效應；通過靶向捕獲測序分析缺失特征；使用人源化TTR外顯子小鼠模型進行臨床前評價；并通過蛋白質組學分析檢測突變TTR肽段。
crRNA篩選與體外編輯效率
研究人員設計了五個靶向小鼠Ttr基因外顯子1和2的crRNA候選分子。通過將每個crRNA克隆至全合一質粒（pCas3）中，該質粒共表達哺乳動物密碼子優化的Cascade-Cas3復合體和EGFP。轉染小鼠肝癌Hepa1-6細胞后，通過流式細胞分選富集EGFP陽性細胞。基因組DNA經PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，crRNA2在體外對外顯子2的編輯效率最高，達到58.9%±0.5%，因此被選用于后續實驗。
特異性評估與脫靶效應分析
通過微滴式數字PCR（ddPCR）分析發現，Cas3-crRNA2編輯的細胞中Ttr外顯子4等位基因的缺失頻率為30.9%±2.2%，而下游B4galt6外顯子9僅顯示輕微編輯（4.4%±2.0%）。靶向捕獲測序顯示，Cas3誘導的缺失長度從25bp到74,709bp不等，平均為8,696bp，且缺失起始位點集中在PAM近端Cascade結合位點上游200bp內。
全基因組測序分析表明，Cas3處理樣本中在Ttr基因座外檢測到的候選缺失區域均對應于重復或低復雜度基因組區域。長讀長測序同樣顯示僅在靶向Ttr基因座有一個主要峰，在潛在脫靶位點或基因組其他位置未檢測到顯著峰。相比之下，Cas9處理樣本在POT1和POT129位點顯示出可重復的脫靶indels。
mRNA優化與體內編輯效果
為提高mRNA穩定性和翻譯效率，研究人員測試了多種內部核苷酸修飾和5'帽結構的組合。結果顯示，Cap1結構能持續增強GFP熒光而不影響細胞活力。基于這些結果，研究人員對所有六個CRISPR-Cas3系統組分采用了類似的修飾，合成了含或不含N1-甲基假尿苷（N1mψ）和Cap1的mRNA。
通過靜脈注射含有化學修飾crRNA（TTR2 Stem1 ver2）和Cascade-Cas3 mRNA的LNP給1月齡Jcl:ICR小鼠，研究人員評估了CRISPR-Cas3的體內基因組編輯能力。血清TTR水平的ELISA檢測顯示，注射后1周，Sep-Cas3-LNP組和DiT-Cas3-LNP組血清TTR水平分別較鹽水對照組降低71.3%±7.1%和77.7%±4.1%。這種降低呈劑量依賴性并持續數周。
為進一步提高編輯效率，研究人員在Cascade-Cas3 mRNA中引入了PureCap Cap2修飾。Cap2相比Cap1能將翻譯效率提高3-4倍。注射Sep-Cas3-Cap2-LNP使血清TTR降低80.1%±4.6%，表明基因組編輯活性增強。肝臟gDNA的ddPCR分析顯示，DiT-Cas3-LNP（6mg kg-1）給藥4周后編輯效率為48.7%±1.1%。
免疫原性與耐受性評估
為評估LNP遞送系統的潛在免疫原性和肝臟蓄積風險，研究人員在DiT-Cas3-LNP給藥后監測了血清細胞因子水平（干擾素-α（IFNα）、腫瘤壞死因子（TNF）、白介素6（IL-6）和單核細胞趨化蛋白1（MCP1））。細胞因子水平在注射后4小時短暫升高，但1周內恢復至基線水平，與空LNP和鹽水對照組相似。Western blot分析顯示，Cas3蛋白在給藥后4和6小時可檢測到，24小時減弱，168小時檢測不到，表明蛋白質表達是瞬時的。
人源化小鼠模型中的編輯效果
為評估體內人TTR基因的基因組編輯，研究人員使用了TTR外顯子人源化小鼠模型，其中所有小鼠Ttr編碼外顯子均被人對應外顯子替換，而內含子和調控元件仍保持小鼠來源。1月齡外顯子人源化小鼠接受單次尾靜脈注射DiT-Cas3-LNP或Cas9/NTLA-2001-LNP。兩組血清人TTR水平均顯著降低：Cas3組降低74.6%±0.6%，Cas9組降低75.9%±0.6%。
通過nanoLC-MS/MS分析，研究人員在Cas9處理小鼠血清中檢測到突變TTR肽段（AADAWEPFASGK，IFM4；p.D39_40TdelinsA），但在Cas3處理小鼠中未檢測到。AlphaFold2預測顯示IFM4改變了TTR單體的局部β-片層結構。體外實驗表明，重組IFM4肽段在酸性條件（pH4.5）下聚集性增加，與ATTRv中特征性的V30M變體相似。SDS-PAGE顯示IFM4和V30M未能形成四聚體，而野生型TTR可以。
8月齡人源化小鼠接受DiT-Cas3-LNP治療后1周，血清TTR水平降低77.8%±9.4%。注射后2個月，免疫熒光分析顯示心臟TTR沉積和相關巨噬細胞浸潤較未處理老年對照組顯著減少。
人細胞系中的編輯評估
在人類肝細胞來源的HepG2細胞中，研究人員對靶向人TTR基因的10個crRNA候選分子進行了全面篩選。ddPCR檢測顯示，crRNA UT05的編輯效率與NTLA-2001無顯著差異。RT-qPCR分析進一步確定多個crRNA（包括UT05、UT06和UT07）能產生相當的TTR mRNA降低效果。
全基因組測序比較顯示，Cas3處理樣本在靶向位點平均缺失大小為3,851bp，最大為43,983bp。質粒遞送的Cas3在B4GALT6外顯子9誘導13.71%缺失，而mRNA遞送的Cas3僅誘導5.02%缺失，與px458遞送的Cas9/NTLA-2001觀察到的4.93%相當。全基因組特異性評估顯示，僅在TTR基因座有一個顯著的缺失峰，無其他明顯峰。
本研究系統評估了CRISPR-Cas3系統在ATTR治療中的應用價值。與目前臨床主流的Cas9系統相比，Cas3表現出獨特的優勢：它能產生長片段缺失，有效避免了可讀框內突變的風險；在全基因組水平顯示出良好的特異性；通過LNP遞送實現了高效的體內編輯效果。這些發現為ATTR及其他遺傳性疾病的治療提供了新的技術路徑。
雖然Cas9基于的療法如NTLA-2001仍是ATTR的臨床標桿，但這項研究為Cas3作為一種獨特且互補的基因組編輯方法提供了初步評估。Cas3的特征性長片段缺失譜及其與Cas9不同的編輯 outcomes，為基因組編輯工具箱增添了重要工具。隨著遞送技術和編輯特異性的進一步優化，CRISPR-Cas3有望在遺傳性疾病治療領域發揮重要作用。
然而，研究也指出了一些需要進一步探討的問題。缺失大小的變異性需要仔細考慮；雖然非編碼區的低頻缺失在觀察期內未引起病理變化，但其長期影響尚需明確；不同遞送方式產生的缺失譜差異提示需要優化遞送策略。此外，全面的安全性研究和長期隨訪數據對于評估其臨床轉化潛力至關重要。
總的來說，這項研究證明了CRISPR-Cas3能在人類細胞和小鼠模型中介導高效的基因組編輯，具有特征性的長片段缺失譜。隨著技術的不斷成熟和優化，CRISPR-Cas3有望成為遺傳性疾病治療領域的重要工具，為患者提供新的治療選擇。
