彌漫性中線膠質(zhì)瘤（DMG）是一種高侵襲性、難治性的兒科癌癥，主要發(fā)生在大腦橋腦干區(qū)域，迫切需要開發(fā)具有代表性的模型來推動治療進展。本研究開發(fā)了一種FGF4驅(qū)動的人腦干類器官模型，并利用其基因工程構(gòu)建了H3.3K27M突變的DMG。我們證明了腦干橋腦膠質(zhì)細胞的特化對于DMG的腫瘤發(fā)生至關重要，由此產(chǎn)生的浸潤性腫瘤再現(xiàn)了患者腫瘤的瘤內(nèi)異質(zhì)性。長期的GD2嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）治療結(jié)果與臨床觀察相似，并揭示了廣泛的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，從中可以識別出強效的效應細胞群和功能失調(diào)的細胞群。此外，整合髓系細胞后，生成了DMG特異性小膠質(zhì)細胞，這些細胞降低了治療療效，并揭示了最易受小膠質(zhì)細胞介導的免疫抑制影響的CAR-T細胞功能狀態(tài)。因此，我們提出了一個具有代表性的DMG模型，提供了長達數(shù)月的體外實驗窗口，并利用該模型闡明了CAR-T細胞的功能和小膠質(zhì)細胞的影響，有助于針對這種毀滅性疾病的療法開發(fā)。

DMG是一種罕見且具有侵襲性的兒科腦瘤，通常由組蛋白H3基因的體細胞突變引起，最常見的是K27M替換。這種腫瘤在腦干橋腦區(qū)域的發(fā)生率極高，主要影響10歲以下兒童，其死亡率是所有癌癥中最高的，中位總生存期僅為9-15個月。這種惡劣的預后迫切需要更好地理解該疾病的生物學特性以開發(fā)有效的治療方法。

單細胞分析顯示，H3K27M突變的DMG具有瘤內(nèi)異質(zhì)性，腫瘤細胞譜系范圍從停滯的干細胞樣少突膠質(zhì)祖細胞（OPC-like）狀態(tài)到更分化的星形膠質(zhì)細胞（AC-like）和少突膠質(zhì)細胞（OC-like）表型，這些表型與正常的發(fā)育細胞類型相似，此外還有一個新近發(fā)現(xiàn)的間充質(zhì)樣（MES-like）狀態(tài)。來自動物和人多能干細胞的研究表明，腫瘤發(fā)生存在一個早期的神經(jīng)發(fā)育窗口。因此，后腦發(fā)育過程中失調(diào)的機制，特別是在負責腦干橋腦形成的區(qū)域的膠質(zhì)祖細胞，可能在驅(qū)動H3K27M突變膠質(zhì)瘤發(fā)生中起核心作用。捕捉這種區(qū)域特異性的胚胎模式對于準確模擬橋腦DMG至關重要。

為了生成具有適合DMG建模的后腦腦干特性的人體類器官，研究人員應用了時序性的形態(tài)發(fā)生素引導，使用了Wnt、雙重SMAD抑制劑、視黃酸（RA）、成纖維細胞生長因子（FGFs）和音猬因子（SHH）的適時序列。與使用FGF2和FGF8結(jié)合RA和Wnt來模式化中腦、小腦或脊髓的類器官不同，本研究評估了FGF4的作用，因為它在指定前腦腦干，特別是橋腦區(qū)域中起作用。與常見的FGF2補充相比，在模式化第7天后用FGF4替代，證明10 ng ml^-1的FGF4能特異性促進橋腦（包括前橋腦到后橋腦區(qū)域）的發(fā)育。

通過時間進程的單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析，從第5天到第120天，研究人員恢復了55,327個高質(zhì)量細胞。使用基于艾倫腦圖譜中小鼠原位雜交數(shù)據(jù)的工具VoxHunt進行空間相似性映射，確認了類器官具有后腦特性，并顯示出更顯著的橋腦特征。細胞注釋顯示，類器官模型包含了從多能干細胞到神經(jīng)上皮和放射狀膠質(zhì)細胞，以及在第14天和第60天分別出現(xiàn)的不同神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞群的轉(zhuǎn)變，反映了神經(jīng)發(fā)生和膠質(zhì)發(fā)生階段的自然分離。與人類神經(jīng)類器官細胞圖譜（HNOCA）相比，腦干類器官（BrO）在膠質(zhì)譜系，特別是膠質(zhì)母細胞和OPC方面顯示出顯著富集。重要的是，與人類發(fā)育腦細胞圖譜（HDBCA）的比較顯示，BrO顯著覆蓋了膠質(zhì)細胞簇，其中13個增加的簇表現(xiàn)出橋腦和延髓特異性身份。因此，新生成的BrO模型為研究橋腦延髓區(qū)域特異性背景下的膠質(zhì)生成提供了一個實驗框架，對DMG建模具有重要意義。

為了研究BrO是否能用于模擬DMG腫瘤，研究人員將表達最常見的H3.3K27M定義性DMG突變的質(zhì)粒，連同典型的伴隨突變和橋腦特異性腫瘤抑制因子TP53和血小板衍生生長因子A（PDGFRA）的 alteration，通過原位電穿孔技術(shù)引入發(fā)育中的BrO。測試了第11天到第28天之間的不同電穿孔時間點，確定第11天是最高效誘導腫瘤性生長的時間點。在這個發(fā)育階段，BrO中以放射狀膠質(zhì)細胞和神經(jīng)上皮干細胞樣細胞為主，這與早期研究將神經(jīng)干細胞識別為H3.3K27M驅(qū)動的腫瘤轉(zhuǎn)化的許可細胞狀態(tài)相一致。

追蹤腫瘤生長超過2個月顯示，產(chǎn)生的腫瘤表現(xiàn)出浸潤性生長。相比之下，使用空載體對照質(zhì)粒僅導致少數(shù)局部電穿孔細胞。在第16周（電穿孔后4個月）進行的全類器官3D成像，按侵襲深度進行顏色編碼，進一步證實了DMG特有的彌漫性生長模式。此外，將DMGOs原位移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，能夠在體內(nèi)進展，表現(xiàn)出侵襲性生長。H3.3K27M表達與顯性陰性TP53（DNp53）和PDGFRA-D842V在蛋白質(zhì)水平上的量化顯示，大多數(shù)GFP陽性細胞都整合了所有三種突變。這些發(fā)現(xiàn)說明了DMG在我們引導的腦類器官中的侵襲性生長依賴于通常觀察到的組合驅(qū)動突變。

為了進一步評估我們體外培養(yǎng)的腫瘤模型（DMGO）的代表性，我們進行了與具有相同突變譜的患者樣本的組織學比較。結(jié)果顯示，H3.3K27M陽性細胞（H3K27M⁺）在患者樣本和DMGOs中均顯示H3K27三甲基化（H3K27me3）的缺失，這是H3K27突變DMG的標志。此外，我們體外培養(yǎng)的腫瘤表現(xiàn)出與DMG高度相似的全局甲基化譜，從而將我們的腫瘤與膠質(zhì)母細胞瘤和具有類似H3K27M三甲基化缺失的后顱窩（PFA1和PFA2）室管膜瘤區(qū)分開來。

接下來，我們對分選的GFP⁺腫瘤細胞進行了scRNA-seq分析，在質(zhì)量控制過濾后，分析了來自14個DMGOs的大約7,000個細胞。從scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷的拷貝數(shù)變異（iCNV）分析進一步支持了這些細胞的惡性狀態(tài)，顯示與健康細胞相比，這些細胞存在大規(guī)模擴增和缺失，包括10號和13號染色體的缺失以及19號染色體長臂（19q）的獲得。使用已發(fā)表的DMG參考文獻，我們首先注釋了先前描述的DMG癌細胞狀態(tài)，包括OPC樣、AC樣和MES樣細胞狀態(tài)以及一群循環(huán)細胞。與我們模型的早期發(fā)育窗口一致，我們只識別出少數(shù)具有更成熟OC樣表型的細胞。重要的是，我們識別出大部分OPC樣腫瘤細胞類似于最近定義的OPC樣2和3狀態(tài)，這兩種狀態(tài)都被描述為兒科和橋腦特異性的前OPC狀態(tài)。此外，我們發(fā)現(xiàn)DMGOs與原發(fā)性DMG患者材料之間的相似性評分最高，而不是與細胞系、患者來源異種移植模型（PDX）以及來自膠質(zhì)母細胞瘤或兩種PFA亞型患者的材料相比�？傊�，這突顯了DMGOs能夠高度模擬原發(fā)性DMG腫瘤的能力。

我們研究了驅(qū)動腫瘤發(fā)生的機制，以確定BrO中哪些屬性對于支持DMG腫瘤生長至關重要。我們使用了TrackerSeq，一種基于PiggyBac的遺傳譜系追蹤方法，并在電穿孔后2個月分析了癌癥克隆動力學。我們檢索了來自6個DMGOs和2個健康BrOs的167個獨特條形碼，并檢測到單個克隆最多可涵蓋約800個細胞，指示了癌性轉(zhuǎn)化。通過比較大克隆與小克隆的差異表達基因（DEG）和METASCAPE分析，我們確定膠質(zhì)特化是驅(qū)動癌癥克隆擴增的關鍵特征，而與神經(jīng)元特化（例如，突觸組織和化學突觸傳遞的調(diào)節(jié)）相關的基因在小克隆中富集。大克隆的特征是OLIG1（一種經(jīng)典的OPC標記物）以及IER2、JUNB、FOS和EGR1的更高基因表達，這些基因先前被描述為OPC樣3前OPC狀態(tài)的關鍵標記物。有趣的是，我們還發(fā)現(xiàn)AQP1的表達更高，這是一種水通道蛋白，先前被證明在人類腦干中僅存在于星形膠質(zhì)細胞中。此外，對患者數(shù)據(jù)的分析顯示，AQP1在位于橋腦的腫瘤中表達，但在來自皮質(zhì)或丘腦區(qū)域的腫瘤中不表達。這些數(shù)據(jù)暗示了一種膠質(zhì)特異性的腫瘤發(fā)生過程，并且該過程進一步依賴于橋腦的位置。通過將大DMG腫瘤克隆中上調(diào)的基因映射回BrO的膠質(zhì)譜系，進一步說明了這一點，表明腫瘤發(fā)生依賴于膠質(zhì)生成。為了通過實驗證實這一點，我們在非引導的腦類器官中進行了突變組合的原位電穿孔，結(jié)果顯示腫瘤誘導減少。此外，其生長是非彌漫性的，幾乎很少有攜帶H3.3K27M替換的GFP陽性腫瘤細胞。這些發(fā)現(xiàn)表明，H3.3K27M驅(qū)動的腫瘤發(fā)生依賴于正確的解剖細胞身份，而我們的BrO模型再現(xiàn)了這一點。

共識非負矩陣分解（cNMF）和譜系關系分析確定惡性元基因程序1和2存在于最多數(shù)量的克隆中（34個克隆中的30個和26個），并且屬于OPC樣譜系，強調(diào)了該譜系在H3K27M DMG腫瘤發(fā)生中的核心作用。更具體地說，我們顯示了與前OPC狀態(tài)，即OPC樣2的重疊。在人類早期妊娠的背景下，膠質(zhì)譜系的區(qū)域特異性基因特征被認為是以膠質(zhì)相關疾�。ㄈ鏒MG）的強烈區(qū)域特異性發(fā)生模式為基礎。與此一致，程序1和程序2都特異性地富集了后腦橋腦少突膠質(zhì)細胞前體譜系，而不是中腦和前腦譜系。總之，這些發(fā)現(xiàn)突出了橋腦膠質(zhì)特化（在BrOs中被捕獲）在驅(qū)動DMG腫瘤發(fā)生中的作用，強調(diào)了在模擬DMG和建立與人類相關的治療測試實驗系統(tǒng)時，空間和發(fā)育精確性的必要性。

鑒于在DMGOs中觀察到的相關腫瘤進展，我們評估了它們作為臨床前測試GD2 CAR-T細胞的人體體外平臺的潛力。通過將未轉(zhuǎn)化的BrOs暴露于GD2 CAR-T細胞，我們首先通過明場成像直觀檢查了GD2 CAR-T細胞的存在不影響模型的總體健康狀態(tài)。接下來，我們確認了DMGO中GD2靶標的表達以及通過共聚焦成像檢測GFP⁺腫瘤細胞中cleaved caspase 3所證實的腫瘤細胞殺傷作用。建立了這些實驗前提后，我們在腫瘤誘導后4個月對DMGOs進行治療，在第0天和第7天施用CD8⁺GD2 CAR-T細胞，并隨時間監(jiān)測T細胞活化（通過干擾素-γ（IFNγ）分泌測量）和腫瘤控制。與個體中報告的異質(zhì)性結(jié)果相似，我們觀察到腫瘤負荷總體部分減少，并且個體DMGOs之間的反應率存在異質(zhì)性。由于所有治療的DMGOs都通過強大的IFNγ反應顯示出明顯的GD2 CAR-T細胞活化，有限的反應譜不太可能是由于抗原識別不足所致。治療效應在治療超過1個月后仍可檢測到，這為在體外模擬CAR-T細胞功能提供了優(yōu)勢，能夠代表體內(nèi)腫瘤部位的T細胞狀態(tài)，包括與長期腫瘤暴露相關的潛在耗竭特征。

為了測試我們的模型用于此目的，我們對從DMGOs中回收的超過20,000個GD2 CAR-T細胞以及未暴露的GD2 CAR-T細胞進行了測序。這揭示了DMGO暴露誘導了相當程度的異質(zhì)性。在從DMGOs回收的GD2 CAR-T細胞中，我們識別出九個轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，基于對精選基因特征的組合 interrogation、差異表達基因（DEG）、DEG相關的基因本體論（GO）術(shù)語、經(jīng)典免疫效應物和耗竭標記物的表達以及與包括腦惡性腫瘤在內(nèi)的泛癌腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）數(shù)據(jù)集的比較，反映了不同的T細胞活化、分化和效應狀態(tài)。例如，我們識別出一個GD2 CAR-T細胞群體，盡管被活化（基于HLA基因表達），但并未完全分化為效應功能（未分化；T_UND），以及一個IL-2反應群體（T_IL-2），可能分化為效應T細胞。此外，我們觀察到一個表達干擾素刺激基因（ISG）的群體（T_ISG），對應于表達ISG的TILs，并被認為是干擾素誘導的活化狀態(tài)。其他簇包括具有遷移特性和互連性的CAR-T細胞群體，其似乎受其神經(jīng)元環(huán)境影響，以及增殖（T_PR）和代謝應激的T細胞（T_MS）。重要的是，我們根據(jù)其細胞毒性特征和假定的耗竭水平區(qū)分了潛在的DMG靶向效應T細胞群體。雖然其中一個簇主要表達GZMK（T_GZK），但細胞毒性T細胞（T_CYT）表達GZMB、PRF1和IFNG。相比之下，耗竭T細胞（T_EX）顯示IFNG減少，并同時表達免疫檢查點基因LAG3、HAVCR2、TIGIT和SELPLG，以及與耗竭相關的轉(zhuǎn)錄抑制因子PRDM1。每周施用CAR-T細胞（第0天和第7天）并未改善T_EX的減少或T_CYT的富集，表明耗竭可能早在第7天就已出現(xiàn)。

為了確認在我們的DMGO模型中檢測到的耗竭反映了腫瘤部位代表性的T細胞耗竭，我們將DMGO暴露后存在的T_EX表型與暴露前的GD2 CAR-T細胞進行了比較，后者盡管通過4-1BB胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域得到緩解，但仍可能顯示出由強直信號傳導導致的耗竭特征。確實，一部分暴露前的GD2 CAR-T細胞與我們暴露于DMGO后檢測到的T_EX簇重疊。然而，根據(jù)實驗條件分離該簇中的細胞顯示，DMGO暴露的T_EX上調(diào)了廣泛的額外耗竭標記物，以及已知的耗竭轉(zhuǎn)錄因子和功能調(diào)節(jié)因子，這些因子包括在跨TIL數(shù)據(jù)集的癌癥患者中描述的那些。此外，與在抗原驅(qū)動的淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒小鼠慢性感染模型以及基于持續(xù)抗原暴露的CAR-T細胞功能障礙體外模型中發(fā)現(xiàn)的耗竭標記物的重疊，證明觀察到的耗竭特征是抗原驅(qū)動的。對于體外模型系統(tǒng)，這在天然表達的腫瘤抗原背景下尚未實現(xiàn)，僅能通過持續(xù)的抗CD3和抗CD28抗體刺激或使用抗原脈沖或過表達的腫瘤細胞系進行多輪刺激來實現(xiàn)。因此，DMGOs模擬了CAR-T細胞的功能異質(zhì)性，包括代表性的T細胞功能耗竭，這是改善結(jié)果的可操作軸，因此是臨床前評估的關鍵因素。

與其強大的細胞毒性和缺乏耗竭一致，T_CYT群體與我們最近識別的“超級接合者”工程化T細胞的“殺手”基因特征重疊，這些細胞在短期共培養(yǎng)測定中具有深遠的腫瘤靶向能力和連續(xù)殺傷行為。由于我們先前將NCAM1識別為富集該群體的選擇標記物，我們利用此策略進一步研究這種CAR-T細胞功能譜在長期治療設置中的相關性。我們在DMGO治療前基于NCAM1表達分選了GD2 CAR-T細胞，并比較了NCAM1⁺和NCAM1^-細胞之間的腫瘤控制。這證明了NCAM1⁺GD2 CAR-T細胞最初的強效抗腫瘤活性，在第2天，其腫瘤控制比NCAM1^-GD2 CAR-T細胞富集了1.4倍。然而，這種增強的效力在第5天到第7天之間趨于穩(wěn)定，NCAM1^-T細胞隨時間推移顯示出更漸進的抗腫瘤活性，到第7天時略微優(yōu)于NCAM1⁺細胞，這與在第14天回收到更多NCAM1^-細胞一致。為了深入了解解釋這些差異結(jié)果的潛在轉(zhuǎn)錄組譜，我們對NCAM1^-和NCAM1⁺GD2 CAR-T細胞進行了scRNA-seq，并將它們映射回我們先前識別的GD2 CAR-T細胞特征。這揭示了一個額外的應激GD2 CAR-T細胞簇，特異于NCAM1^-細胞（T_HS），其通過熱休克蛋白的表達與T_MS簇區(qū)分開來，并與在TILs中識別的、與免疫治療耐藥相關的應激反應狀態(tài)重疊。進一步與最初觀察到的增強的腫瘤控制一致，NCAM1⁺細胞顯示T_CYT比NCAM1^-細胞富集了3.3倍。然而，與細胞持久性差一致，NCAM1⁺T細胞還富集了T_EX，這解釋了它們隨時間推移性能下降的原因�？傊�，這將NCAM1⁺細胞識別為一個強效的腫瘤靶向、但短命的效應GD2 CAR-T細胞群體，并提供了在給藥前通過細胞選擇來縮小CAR-T細胞功能異質(zhì)性的概念驗證。

與組織駐留相關的特征的上調(diào)，包括用于識別組織駐留T細胞的經(jīng)典標記物CD103（ITGAE），強調(diào)了DMGOs模擬組織內(nèi)T細胞性能的能力。雖然這可能為增強CAR-T細胞運輸和組織駐留的策略提供信息，但DMGOs缺乏髓系區(qū)室，這是T細胞反應的關鍵調(diào)節(jié)器。因此，為了增強DMGOs的復雜性，我們整合了小膠質(zhì)細胞，這是DMG腫瘤微環(huán)境的一個主要組成部分。我們從hES細胞生成了原始巨噬細胞祖細胞（PMPs），先前已證明其能在小鼠大腦和人中腦類器官中分化為成熟小膠質(zhì)細胞，并在與神經(jīng)元共培養(yǎng)時也能如此。PMPs類似地整合到BrOs中，并在7天內(nèi)呈現(xiàn)出穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細胞特征的分支形態(tài)。確認功能成熟后，這些細胞表現(xiàn)出典型的小膠質(zhì)細胞行為，遷移到髓鞘注射部位，并通過吞噬作用清除髓鞘。此外，在整合到BrOs中3周后，超過80%的細胞在蛋白質(zhì)水平上表達小膠質(zhì)細胞特異性標記物P2RY12，并且scRNA-seq分析證明小膠質(zhì)細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達增加。此外，當參考小鼠中識別的小膠質(zhì)細胞發(fā)育程序時，它們類似于成年狀態(tài)，進一步驗證了小膠質(zhì)細胞的成熟。與來自DMG腫瘤的髓系細胞參考數(shù)據(jù)集的比較確認了小膠質(zhì)細胞而非巨噬細胞的身份。

在腫瘤攜帶的DMGOs中整合小膠質(zhì)細胞導致獲得了最近描述的DMG相關功能表型，包括干擾素活化、吞噬脂質(zhì)和缺氧狀態(tài)。此外，與BrOs相比，來自DMGOs的小膠質(zhì)細胞顯示出與抗原呈遞和免疫反應相關的GO術(shù)語富集，例如主要組織相容性復合體II類介導的肽加工和I型干擾素反應，這些先前被描述為在DMG相關的小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞中上調(diào)。這些DMG特異性小膠質(zhì)細胞狀態(tài)伴隨著趨化因子表達的減少和與免疫抑制譜相關的基因的上調(diào)，這與患者數(shù)據(jù)一致。這通過CD163（與抗炎狀態(tài)相關）和SPP1（與免疫抑制的脂質(zhì)負載巨噬細胞相關）的蛋白質(zhì)表達得到證實。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明，在適當?shù)纳窠?jīng)元環(huán)境中，PMPs分化為成熟的小膠質(zhì)細胞，