基因編輯技術，特別是CRISPR/Cas9及其快速發展的衍生工具，正在徹底改變遺傳性疾病的治療格局。這些技術通過操縱患者基因組，有望實現對遺傳病根本原因的持久性矯正。然而，這些基因組編輯技術的成功臨床應用，需要將必需的生物分子組分（如Cas9核酸酶、向導RNA和/或同源供體DNA模板）協調地遞送至細胞內。脂質納米顆粒（LNP）作為一種有前景的基因遞送平臺，在輝瑞-BioNTech和Moderna的COVID-19 mRNA疫苗取得廣泛成功后備受關注。囊性纖維化（CF）是由單基因——囊性纖維化跨膜電導調節因子（CFTR）基因——突變引起的遺傳病，是基因治療的理想目標。盡管許多患者可通過調節CFTR蛋白功能的藥物進行治療，但約10%患者的突變類型對這些干預措施無反應，且這些突變在非白人患者群體中比例過高。因此，針對這些無法治療突變的基因療法具有重大意義。

近年來，已有研究證明LNP能在CF模型中實現穩健的基因編輯，但多數策略依賴于短的單鏈寡核苷酸（ssODN）供體模板或堿基編輯器來糾正特定的單個突變。相比之下，依賴于大DNA供體模板的CRISPR策略（如Cas9介導的HDR整合）具有獨特優勢：首先，插入長編碼序列提供了一種突變非依賴性的解決方案，無需針對特定突變進行定制，有利于“現貨型”療法的轉化，降低成本并增強可擴展性；其次，插入整個校正后的基因允許使用密碼子優化和/或功能增益變體的供體盒，可能克服遞送和編輯效率的限制。然而，合成納米載體（如LNP）對這些大容量貨物的包載能力仍知之甚少，尤其是對于線性雙鏈DNA（ldsDNA）的遞送。ldsDNA分子比其單鏈對應物分子量更大、剛性更強，因此更難以卷曲。

本研究報道了一種LNP平臺的設計與驗證，該平臺可同時包載編碼Cas9的mRNA轉錄本、單向導RNA（sgRNA）和大的ldsDNA供體模板貨物。這些試劑旨在通過同源定向修復（HDR）介導的位點特異性整合，將密碼子優化的、包含5 kb CFTR編碼序列和50 bp同源臂的供體模板插入內源性CFTR基因的5‘非翻譯區（UTR），同時保持內源性CFTR啟動子和內含子的完整，以實現對任何CF致病突變的校正。

傳統的LNP配方包含可電離脂質、輔助磷脂、固醇和聚乙二醇（PEG）綴合脂質。這些成分的確切身份和摩爾比需要根據應用進行優化。本研究旨在建立一種針對疾病相關的人支氣管上皮細胞系（16HBE14o-）優化的LNP配方。經過篩選，最終確定的優化配方包含50 mol% SM-102、38.5 mol% β-谷固醇、10 mol% 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）和1.5 mol% 1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DMG-PEG₂₀₀₀）。該配方在16HBE14o-細胞中實現了95%的轉染效率，并保持了80%以上的細胞活力。

為實現HDR介導的位點特異性插入，需要細胞內遞送編碼Cas9內切核酸酶的mRNA轉錄本、靶向特定基因組位點的sgRNA以及作為插入序列模板的供體DNA構建體。研究團隊利用穩定表達藍色熒光蛋白（BFP）的16HBE14o-報告細胞系，系統篩選了mRNA、sgRNA和單鏈寡核苷酸（ssODN）供體之間的最佳重量比（w/w）。首先固定ssODN:mRNA比例為3:1，滴定sgRNA:mRNA比例（0.8:1至2:1），發現sgRNA:mRNA比例為1.2:1時HDR效率最高。隨后固定sgRNA:mRNA比例為1.2:1，滴定ssODN:mRNA比例（2:1至4:1），確定ssODN:mRNA比例為3:1時HDR效率最優。因此，后續實驗采用sgRNA:mRNA為1.2:1 w/w，ssODN:mRNA為3:1 w/w的比例。

為進一步評估LNP遞送更大ldsDNA供體模板（編碼完整基因）的能力，研究設計了靶向內源性CFTR基因5‘UTR的mCitrine報告基因ldsDNA構建體。比較了將ldsDNA與RNA貨物分裝于不同LNP（sepLNPs） versus 將所有三種基因編輯組分共同包載于單一LNP（togLNPs）的效果。結果表明，togLNPs在實現位點特異性整合效率方面優于sepLNPs，無論是否使用DNA依賴性蛋白激酶抑制劑AZD7648和DNA聚合酶θ（PolΘ）抑制劑ART558來抑制競爭性的修復途徑（非同源末端連接NHEJ和微同源介導的末端連接MMEJ）。當使用編碼全長CFTR（約5 kb）的更大ldsDNA供體時，需要進一步優化。通過篩選ldsDNA:mRNA比例（2:1, 3:1, 4:1 w/w）和氮磷比（N/P ratio, 5, 7, 9, 11, 13），發現ldsDNA:mRNA為3:1 w/w且N/P為11時，在G542X突變細胞中實現了最高約3.5%的整合效率，且細胞存活率良好。劑量滴定實驗表明，50 ng mRNA劑量即可達到約3.3%-3.5%的整合效率。

實驗驗證了AZD7648和ART558并非實現有效整合所必需，未使用藥物的樣本仍能達到約2.85%的整合效率。盡管等位基因整合效率低于4%，但Western blot蛋白印跡分析顯示，經過編輯的G542X細胞（G542X-CFTR）的CFTR蛋白表達量達到正常16HBE14o-對照組的83%-123%。功能測定（使用2通道尤斯灌流室系統和24通道跨上皮電流鉗TECC系統）表明，G542X-CFTR細胞單層的CFTR氯離子電流恢復至正常16HBE14o-細胞單層電流值的約80%-160%，且所有樣本的跨上皮電阻（TEER）均大于800 Ω×cm²。這首次證明了LNP平臺可包載并遞送如此大小的ldsDNA盒，通過位點特異性插入整個基因序列實現功能表型挽救。

通過低溫透射電子顯微鏡（cryo-TEM）對僅含Cas9 mRNA和sgRNA、僅含CFTR編碼ldsDNA、以及同時含三者（Cas9 mRNA、sgRNA、CFTR ldsDNA）的LNP進行了表征。所有三種LNP類型主要包含尺寸約30-100 nm的顆粒，具有圓形或多面體形態及電子致密的多層膜核心。然而，在含有ldsDNA的樣品中也觀察到了非常大（>200 nm）且形態不規則的顆粒。這種異質性與動態光散射（DLS）和RiboGreen assay測得的更寬的尺寸分布和較低的包封效率一致。cryo-TEM圖像證實了在所有樣品中均形成了包載核酸的多層膜顆粒，表明大的ldsDNA構建體可以被包載在LNP內。

本研究證實了由市售脂質試劑組裝的LNP能夠包載并促進ldsDNA貨物的遞送，并能用于協調CRISPR/Cas9系統的所有組分遞送至患有罕見CF致病突變G542X的純合子人支氣管上皮細胞，實現編碼整個CFTR基因的HDR供體模板的位點特異性插入，從而恢復氣道上皮的蛋白表達和正確的離子通道功能。與僅含RNA的LNP相比，含ldsDNA的LNP在形態上存在差異（如總體尺寸更大、多分散性更高、包封效率更低），這可能源于ldsDNA供體更大的尺寸和/或剛性導致的組裝熱力學改變，或空間位阻影響了可電離脂質胺與ldsDNA磷酸骨架的靜電相互作用。盡管CFTR整合效率相對 modest，但在編輯樣本中觀察到的高頻率（40%-60%）插入缺失（indel）表明，細胞的攝取和內體逃逸可能并非該平臺的主要限制因素。限制效率的因素更可能在于細胞內部生物學過程，例如供體向細胞核的運輸效率低，以及HDR效率本身受細胞周期依賴性和競爭性修復途徑（NHEJ, MMEJ）的限制。本研究證明，即使整合水平低于3%，使用密碼子優化的ldsDNA供體盒也能實現CFTR離子通道功能的強勁恢復，這為克服遞送和整合效率障礙提供了潛在解決方案。該LNP平臺具有模塊化特點，易于與專門設計用于克服CF治療面臨的物理和免疫障礙的其他LNP技術結合。

本研究成功證明了LNP介導的整個基因整合可實現功能性表型矯正，為LNP的貨物攜帶能力設立了新基準。具備此能力的LNP為突變非依賴性校正多種單基因疾�。ㄈ缪�友病A、腺苷脫氨酶缺乏性重癥聯合免疫缺陷癥ADA-SCID）提供了靈活的平臺。未來需要針對ldsDNA構建體的包載和遞送，設計和測試大規模的可電離脂質庫，優化LNP配方，以推動可臨床轉化的基因療法的發展。

（此部分詳細描述了研究所用的化學品、LNP的配制合成與表征方法、細胞培養條件、轉染流程、流式細胞術、活細胞核染色與共聚焦顯微鏡、DNA提取與分析、尤斯灌流室分析、TECC分析、Western blot、雙鏈DNA供體合成與擴增、液滴數字PCR（ddPCR）整合分析、等位基因破壞測量、BFP報告細胞系構建以及統計學分析方法等具體實驗步驟和條件。）