空間生物學作為基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)和精準醫(yī)學的新前沿，其技術(shù)如空間蛋白質(zhì)組學能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)表達的高分辨率圖譜繪制，從而改變我們對生物學和疾病的理解。然而，其臨床轉(zhuǎn)化仍面臨成本、復雜性和可擴展性等重大挑戰(zhàn)。本研究提出了一種名為H&E to protein expression (HEX)的人工智能模型，旨在直接從標準組織病理學切片計算生成空間蛋白質(zhì)組學圖譜。

研究團隊對來自10例非小細胞肺癌（NSCLC）患者的腫瘤樣本的同一組織切片進行了CODEX（Co-detection by indexing）和高通量免疫熒光成像以及H&E染色。CODEX實驗設(shè)計了一個包含40種蛋白質(zhì)的檢測 panel，涵蓋了譜系、免疫、結(jié)構(gòu)和功能標志物，能夠全面表征腫瘤微環(huán)境（TME）的空間表型。兩種實驗獲得的整張切片圖像（WSI）經(jīng)過配準后，被裁剪成約50微米大小的小圖像塊，最終獲得了約75.5萬個具有40種蛋白質(zhì)生物標志物表達及其匹配的H&E組織病理學圖像塊的數(shù)據(jù)集，用于模型訓練。

HEX模型利用了最先進的病理學基礎(chǔ)模型（如MUSK），基于H&E圖像同時預測40種蛋白質(zhì)生物標志物的表達，從而能夠從標準組織病理學中生成虛擬空間蛋白質(zhì)組學圖譜。模型的蛋白質(zhì)表達準確性在兩個獨立數(shù)據(jù)集（共372個腫瘤樣本）上進行了評估。為了評估HEX在NSCLC之外的泛化性，還在一個包含34種組織類型、206個腫瘤樣本的泛癌數(shù)據(jù)集上進行了外部驗證，該數(shù)據(jù)集包含57重CODEX和匹配的H&E圖像。

研究通過交叉驗證和獨立驗證評估了HEX的性能，并使用了四個互補的指標：皮爾遜相關(guān)系數(shù)（r）、斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)（r）、結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)（SSIM）和均方誤差（MSE）。HEX的表現(xiàn)與兩種基于生成對抗網(wǎng)絡(luò)（GAN）的組織學圖像轉(zhuǎn)換方法進行了比較。

在斯坦福-WSI數(shù)據(jù)集上進行五折交叉驗證的結(jié)果顯示，HEX能夠從H&E圖像中準確預測蛋白質(zhì)表達，平均皮爾遜r為0.790，斯皮爾曼r為0.787，SSIM為0.949，MSE為0.076。HEX consistently outperformed both GAN methods, with substantial improvements of 46% in Pearson’s r, 44% in Spearman’s r, 15% in SSIM and an 80% reduction in MSE compared with the second-best model, conditional GAN (CGAN).

為了定性評估預測生物標志物的空間模式，研究可視化了真實的CODEX圖像以及從H&E圖像生成的虛擬CODEX圖像。HEX模型能夠生成高保真度的虛擬CODEX圖像，準確反映了結(jié)構(gòu)、免疫、譜系和功能標志物的空間組織和表達模式。值得注意的是，HEX能夠以用戶指定的任何空間分辨率生成虛擬CODEX圖像。通過使用更小的窗口和步長（從224像素降至14像素）進行訓練，HEX能夠輸出高分辨率的虛擬CODEX結(jié)果，并增強對細粒度空間模式的可視化。

在獨立驗證方面，研究將模型在完整的斯坦福-WSI數(shù)據(jù)集上訓練后，在兩個獨立的組織微陣列（TMA）隊列（斯坦福-TMA和TA-TMA，共372個腫瘤樣本）上評估其性能。HEX在所有40種生物標志物上均表現(xiàn)出 consistently high Pearson’s r values。在第一個斯坦福-TMA數(shù)據(jù)集上，HEX在所有生物標志物上的平均皮爾遜r為0.738，斯皮爾曼r為0.741，SSIM為0.875，MSE為0.189。與第二好的模型（CGAN）相比，HEX nearly doubled the key performance metrics。在第二個TMA數(shù)據(jù)集上，HEX同樣表現(xiàn)出強大的預測性能。這些結(jié)果共同凸顯了HEX在獨立數(shù)據(jù)集上的泛化性和穩(wěn)健性，且HEX在各種評估指標上均顯著優(yōu)于現(xiàn)有方法。

研究還通過亞細胞定位（核、胞質(zhì)、膜）對性能進行了分層，觀察到各組間具有可比性的準確性。此外，在一個公開的泛癌數(shù)據(jù)集上的外部驗證表明，盡管存在組織類型、染色方案和成像平臺的差異，HEX在不進行微調(diào)的情況下，在24種重疊的生物標志物上仍取得了強大的預測性能（平均皮爾遜r：0.658），僅略低于在斯坦福數(shù)據(jù)集上的表現(xiàn)（平均皮爾遜r：0.718）。HEX還 substantially outperformed the second-best model (CGAN) across all evaluation metrics。這些結(jié)果證明了HEX在不同組織類型、染色方案和成像平臺間的穩(wěn)健性和泛化性。

為了評估HEX對新組織類型和擴展生物標志物panel的適應(yīng)性，研究在來自伯爾尼數(shù)據(jù)集的140個結(jié)直腸癌（CRC）核心上進行了重新訓練和微調(diào)實驗，使用了全部57種蛋白質(zhì)標志物——其中33種不在原始的NSCLC panel中。當從頭開始重新訓練時，HEX取得了良好的預測性能（平均皮爾遜r：0.566），表明其能夠泛化到不同組織中的新蛋白質(zhì)標志物。對經(jīng)過NSCLC訓練的HEX模型進行微調(diào)——通過重新初始化輸出頭并適應(yīng)CRC數(shù)據(jù)——進一步提高了性能（平均皮爾遜r：0.659）。值得注意的是，在共享的和CRC特有的生物標志物上都觀察到了改進。這些結(jié)果證實，HEX可以通過最小的架構(gòu)更改和有限的訓練數(shù)據(jù)，有效地適應(yīng)新的組織和標志物panel，從而實現(xiàn)在不同組織學背景下虛擬空間蛋白質(zhì)組學的可擴展部署。

研究還使用匹配的免疫組織化學（IHC）和H&E切片對HEX衍生的空間蛋白質(zhì)組學進行了正交驗證。在三個肺腫瘤上的評估顯示，HEX預測的IHC測量結(jié)果具有良好的空間一致性——皮爾遜r分別為0.479（CD31）和0.606（Ki-67）——并且顯著優(yōu)于CGAN基線。

最后，研究評估了使用不同基礎(chǔ)模型主干和訓練策略的影響。基于MUSK主干初始化的HEX模型獲得了最高的總體準確度，而基于CONCH主干的模型顯示出更快的推理速度，但準確度較低。為了剖析訓練策略的作用，研究進行了消融實驗，從原始HEX模型中移除特征分布平滑（FDS）或自適應(yīng)損失函數(shù)（ALF）。在兩種情況下，模型在所有指標上的性能均顯著下降，表明這些組件對于實現(xiàn)穩(wěn)健和可泛化的預測是必要的。

通過從標準H&E圖像生成空間蛋白質(zhì)組學的能力，HEX通過增加一層分子洞察力，實現(xiàn)了具有生物學可解釋性的臨床相關(guān)結(jié)局預測。雖然H&E提供了詳細的組織形態(tài)學信息，但虛擬CODEX圖譜提供了關(guān)于空間分辨的蛋白質(zhì)表達的補充信息。為了整合這些不同但協(xié)同的數(shù)據(jù)類型，研究開發(fā)了多模態(tài)整合 via co-attention (MICA)，這是一個深度學習框架，在早期階段融合H&E和虛擬CODEX數(shù)據(jù)。這種方法顯式地建模跨模態(tài)交互和空間關(guān)系，增強了其識別與患者結(jié)局預測相關(guān)的臨床特征的能力。

研究在五個獨立的NSCLC隊列中評估了基于MICA的風險預測的預后效用。使用來自美國國家肺部篩查試驗（NLST）的數(shù)據(jù)，訓練了一個模型來從H&E染色的WSI預測無復發(fā)生存期（RFS），然后在其他四個患者隊列中進行測試，包括癌癥基因組圖譜（TCGA）、前列腺、肺、結(jié)直腸和卵巢（PLCO）癌癥篩查試驗、斯坦福-TMA和TA-TMA隊列。Kaplan-Meier分析表明，在訓練和驗證隊列中，風險分層均顯著且穩(wěn)健。MICA定義的高風險和低風險患者之間的風險比（HR）在驗證隊列中，對于I期NSCLC為2.43-3.33（所有P ≤ 0.002），對于II期NSCLC為2.27-4.28（所有P ≤ 0.012）。在TA-TMA隊列中，對于總生存期（OS）也觀察到了類似的結(jié)果。

使用一致性指數(shù)（C-index）進行的定量評估進一步證實了MICA風險模型的預后性能。對于早期疾病患者，MICA實現(xiàn)的C-index分別為0.80（NLST）、0.67（TCGA）、0.68（Stanford-TMA）、0.72（PLCO）和0.62（TA-TMA）。在四個驗證隊列中，MICA達到了總體調(diào)整后的C-index為0.68（按患者數(shù)量加權(quán)），顯著優(yōu)于僅使用H&E的模型（總體C-index：0.56；所有P ≤ 0.016）和僅使用虛擬CODEX的模型（總體C-index：0.59）。

MICA風險模型在早期NSCLC的預后預測方面也優(yōu)于傳統(tǒng)的臨床病理學變量，包括腫瘤分期和分級。多變量Cox回歸分析進一步證實，MICA衍生的風險評分是所有患者隊列中臨床結(jié)局（RFS、疾病特異性生存期（DSS）和總生存期）的最強獨立預測因子。重要的是，將MICA衍生的評分與年齡、性別、分級和分期等標準風險因素相結(jié)合，與單獨使用臨床變量相比，顯著提高了早期NSCLC的預后準確性（總體C-index：0.71 對 0.58；所有P ≤ 0.002）。預后準確性大幅提高22%，凸顯了融合H&E圖像和虛擬空間蛋白質(zhì)組學在超越傳統(tǒng)臨床病理學風險因素方面提供的補充信息的價值。

額外的分析證實了其在不同疾病分期和臨床亞組中的穩(wěn)健性、每個隊列內(nèi)的交叉驗證以及相對于后期融合基線（PORPOISE）在交叉驗證和獨立驗證中的優(yōu)勢。此外，在12個TCGA癌癥類型中，MICA在五折交叉驗證下優(yōu)于兩個單模態(tài)基線。

為了比較虛擬空間蛋白質(zhì)組學與實驗獲取的空間蛋白質(zhì)組學的預后價值，研究將NLST訓練的模型應(yīng)用于兩個具有匹配H&E和真實CODEX數(shù)據(jù)的獨立隊列（斯坦福-TMA和TA-TMA）。比較了三個模型：（1）僅使用H&E的基線；（2）使用HEX生成的虛擬CODEX的MICA（MICA-Virtual）；（3）使用真實CODEX的MICA（MICA-True）。結(jié)果顯示，MICA-Virtual和MICA-True模型在預后準確性方面均顯著優(yōu)于僅使用H&E的模型。重要的是，MICA-True和MICA-Virtual之間的C-index在任一隊列中均無統(tǒng)計學顯著差異。這些結(jié)果表明，HEX衍生的虛擬CODEX可以提供超越H&E的額外預后信息，其價值等同于真實的CODEX數(shù)據(jù)。

HEX方法不僅能夠?qū)崿F(xiàn)準確的預后預測，還能為預測背后的原因提供生物學解釋。研究展示了從標準H&E圖像生成的虛擬空間蛋白質(zhì)組學圖譜，對應(yīng)于模型預測的高風險和低風險患者的關(guān)鍵生物標志物。這使得能夠?qū)⒔M織形態(tài)學與空間分辨的蛋白質(zhì)表達聯(lián)系起來，并精確定位對患者風險貢獻最大的感興趣區(qū)域。

為了評估模型預測的生物學相關(guān)性，研究應(yīng)用積分梯度方法計算了圖像塊水平的歸因分數(shù)。然后將NLST隊列中具有最高和最低積分梯度值的圖像塊——分別代表對模型風險預測影響最大的圖像塊——歸類為高風險組和低風險組。在形態(tài)學上，在高風險圖像塊中觀察到組織學模式，如低分化、淋巴血管浸潤、壞死和微乳頭狀模式。相反，低風險圖像塊包括具有鱗屑樣生長、高分化腫瘤、豐富的腫瘤浸潤淋巴細胞和三級淋巴結(jié)構(gòu)的區(qū)域——這些模式與已知的預后相關(guān)性一致。

然后，研究比較了不同風險組之間虛擬CODEX圖像中的蛋白質(zhì)表達譜。低風險組富含免疫標志物，如CD20、CD3e、CD8和顆粒酶B（granzyme B）。相比之下，高風險組顯示增殖標志物（Ki-67）、上皮標志物（上皮細胞粘附分子（EpCAM）和廣譜細胞角蛋白（PanCK））、間質(zhì)標志物（α-平滑肌肌動蛋白）和血管生成標志物（CD31）的表達增加。對所有40種生物標志物的比較也提供了類似的結(jié)果。

為了進一步探索不同生物標志物的空間共定位模式，研究量化了具有生物標志物對高共表達值的圖像塊的比例。觀察到CD3e⁺/PanCK⁺圖像塊的比例在低風險組中顯著更高，這與上皮內(nèi)免疫浸潤一致。相反，高風險組表現(xiàn)出顯著更高比例的Ki-67⁺/PanCK⁺和CD44⁺/EpCAM⁺圖像塊，反映了增殖性腫瘤和癌癥干細胞生態(tài)位。

為了確認這些空間模式的預后意義，研究在患者水平計算了具有HEX預測的高共表達模式的圖像塊數(shù)量，并將患者分為高計數(shù)組和低計數(shù)組。在NLST隊列中，具有高比例CD3e⁺/PanCK⁺圖像塊的患者具有更好的生存結(jié)局（HR = 0.58；P = 0.001），而那些具有高比例Ki-67⁺/PanCK⁺或CD44⁺/EpCAM⁺圖像塊的患者生存期顯著更差（HR分別為1.64（P = 0.001）和1.56（P = 0.005））。為了進一步驗證這些發(fā)現(xiàn)，研究在斯坦福-TMA隊列中使用真實的CODEX圖像計算了相同的空間生物標志物，并且確實在所有三種生物標志物上都觀察到了相同的預后模式。總體而言，這些結(jié)果表明HEX方法有效地將組織形態(tài)學與空間分辨的蛋白質(zhì)表達相結(jié)合，實現(xiàn)了對患者預后的具有生物學可解釋性的預測。

最后，研究評估了HEX基于標準H&E染色WSI預測免疫檢查點抑制劑（ICI）反應(yīng)和結(jié)局的能力。研究收集了148例接受抗程序性死亡蛋白-1（PD-1）或程序性死亡配體1（PD-L1）ICI治療的晚期NSCLC患者的數(shù)字化H&E切片、臨床數(shù)據(jù)和結(jié)局。HEX被用于從H&E圖像生成虛擬CODEX圖譜，然后通過MICA框架將這些圖譜與組織學特征整合，用于結(jié)局預測。

對于客觀緩解（OR）預測，MICA實現(xiàn)的受試者工作特征曲線下面積（AUC）為0.82（95%置信區(qū)間（CI）：0.73–0.90），顯著優(yōu)于僅使用H&E的模型（AUC為0.72（95% CI：0.59–0.80））和僅使用虛擬CODEX的模型（AUC為0.75（95% CI：0.62–0.84））（所有P < 0.001）。僅使用CODEX的模型的強勁表現(xiàn)表明，HEX推斷的空間蛋白質(zhì)組學捕獲了決定治療反應(yīng)的關(guān)鍵生物學信息。MICA的表現(xiàn)也優(yōu)于臨床批準的檢測方法，如PD-L1表達（AUC = 0.66；95% CI：0.54–0.77；P < 0.05）和腫瘤突變負荷（TMB）（AUC = 0.59；95% CI：0.37–0.80；P < 0.05）。

在預測無進展生存期（PFS）方面，MICA實現(xiàn)的C-index為0.72（95% CI：0.65–0.76），顯著優(yōu)于僅使用H&E的模型（C-index：0.62；95% CI：0.56–0.67）和僅使用虛擬CODEX的模型（C-index：0.66；95% CI：0.61–0.72）（所有P < 0.001）。值得注意的是，MICA在預測PFS方面也優(yōu)于PD-L1和TMB等現(xiàn)有生物標志物。為了評估MICA是否提供額外的預測價值，研究納入了標準臨床變量，包括年齡、性別、體重指數(shù)（BMI）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移、吸煙狀況和PD-L1表達。在多變量Cox回歸分析中，MICA仍然是PFS最顯著的獨立預測因子（HR = 1.67；95% CI：1.36–2.05；P < 0.001）。

研究進一步評估了MICA對患者進行PFS分層的能力。Kaplan-Meier分析揭示了高風險組和低風險組之間的清晰分離（HR = 3.11；95% CI：2.11–4.57；P < 0.001），中位PFS時間分別為4.4個月和15.1個月。相比之下，單獨使用PD-L1表達并不能顯著區(qū)分患者結(jié)局。重要的是，MICA在臨床相關(guān)亞組中保持了穩(wěn)健的分層能力，包括PD-L1表達水平、免疫治療線數(shù)以及ICI單藥治療與ICI聯(lián)合化療方案。這些結(jié)果共同證實了虛擬空間蛋白質(zhì)組學的附加預測價值，并表明像MICA這樣的有效融合策略允許基于標準組織病理學更準確地預測免疫治療反應(yīng)和結(jié)局。

為了更好地理解模型在免疫治療背景下的預測，研究分析了與治療獲益相關(guān)的組織病理學推斷的虛擬空間蛋白質(zhì)組學譜。使用與預后解釋相同的方法，根據(jù)積分梯度分數(shù)將圖像塊分為高風險和低風險類別。然后比較了兩個風險組之間虛擬CODEX圖像中的蛋白質(zhì)表達值。低風險組顯著富集了免疫相關(guān)標志物，如CD138、CD3e、CD8和TCF-1，而高風險組則表現(xiàn)出與免疫抑制或纖維化成分相關(guān)的標志物表達升高，包括CD66b、CD163、FAP和膠原蛋白IV（collagen IV）。

為了更深入地了解與免疫治療反應(yīng)相關(guān)的細胞狀態(tài)，研究檢查了標志物定義的免疫和基質(zhì)細胞狀態(tài)的分布。研究沒有窮舉所有可能的組合，而是采取了一種基于生物學知識的方法，重點關(guān)注六個雙標志物對，基于它們已確立的功能相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)低風險組顯著富集granzyme B⁺/CD8⁺（細胞毒性效應(yīng)T細胞）、TCF-1⁺/CD4⁺（輔助性T細胞）和PD-1⁺/CD8⁺（耗竭T細胞）。相比之下，高風險組富集了CD66b⁺/MMP9⁺（促腫瘤中性粒細胞）、FAP⁺/collagen IV⁺（細胞外基質(zhì)重塑成纖維細胞）和CD163⁺/MMP9⁺（M2樣腫瘤相關(guān)巨噬細胞），反映了兩組之間不同的腫瘤微環(huán)境。

研究進一步通過評估細胞類型和狀態(tài)的成對相互作用，使用歸一化Jaccard指數(shù)來量化空間共定位特征（SCS）。研究發(fā)現(xiàn)低風險組的特征在于各種T細胞亞群的協(xié)調(diào)空間共定位，包括效應(yīng)性和耗竭性T細胞以及輔助性T細胞。相比之下，高風險組表現(xiàn)出更強的免疫抑制性腫瘤相關(guān)巨噬細胞和中性粒細胞的共定位（CD66b⁺/MMP9⁺和CD163⁺/MMP9⁺）。為了說明這些概念，研究展示了兩個模型預測的高風險和低風險患者的配對H&E和虛擬CODEX可視化示例，展示了模型如何捕獲與免疫治療反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵空間蛋白質(zhì)組學特征。

最后，為了評估這些SCS的預后相關(guān)性，研究計算了每個患者每個SCS呈陽性的圖像塊數(shù)量，并將患者分為高計數(shù)組和低計數(shù)組。具有高計數(shù)CD66b⁺/MMP9⁺和CD163⁺/MMP9⁺SCSs的患者結(jié)局顯著更差（HR = 2.38；95% CI：1.63–3.48；P < 0.001），而富含TCF-1⁺/CD4⁺和PD-1⁺/CD8⁺或granzyme B⁺/CD8⁺和PD-1⁺/CD8⁺特征的患者顯示出顯著改善的結(jié)局（HR分別為0.58（95% CI：0.39–0.85；P = 0