《Poultry Science》：Optimization of Electroporation Conditions for Sperm Cells of Jiangxi Kangle Chicken (
Gallus gallus)
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本研究針對傳統禽類基因編輯效率低、操作復雜等問題，通過系統優化江西康樂雞精子電穿孔條件（電壓、脈沖數、脈沖時長），建立了高效、損傷小的精子轉染方案。結果表明，在100 V、5 ms、5脈沖條件下，外源DNA攝取效率達57.1%，且精子關鍵受精能力參數（前向運動力、頂體完整性、線粒體膜電位）無顯著變化，為精子轉染輔助基因編輯（STAGE）技術在禽類育種中的應用提供了重要技術支撐。
在當今全球家禽產業中，基因編輯技術正發揮著越來越重要的作用，例如通過增強經濟性狀、培育抗病品系、開發載體疫苗、改善動物福利、提升禽蛋食用安全性以及在雞蛋中生產藥用蛋白等。然而，目前禽類基因編輯主要依賴傳統的體外或體內原始生殖細胞（Primordial Germ Cell, PGC）途徑，其編輯效率相對較低，且通常需要篩選兩代以上才能獲得純合基因編輯個體，過程耗時費力。因此，開發一種更高效、更簡捷的禽類基因編輯方法成為該領域亟待解決的問題。
在此背景下，精子轉染輔助基因編輯（Sperm Transfection Assisted Gene Editing, STAGE）技術應運而生。該技術通過在受精前將外源基因編輯元件導入精子細胞，再利用人工授精或體外受精產生轉基因個體，有望規避復雜的胚胎操作，縮短育種周期。電穿孔技術作為一種安全、經濟且操作簡單的物理轉染方法，被廣泛應用于將外源DNA、RNA或蛋白質導入細胞。但其應用于禽類精子，特別是江西康樂雞（Gallus gallus）精子的最佳條件尚不明確。為了推動STAGE技術在禽類基因編輯中的應用，研究人員迫切需要優化雞精子的電穿孔條件，在保證高轉染效率的同時，最大限度地維持精子的受精潛能。
本研究旨在系統優化江西康樂雞精子的電穿孔條件，并全面評估轉染后精子的生理狀態。研究論文發表在《Poultry Science》上。
為了達成研究目標，研究人員主要運用了以下幾項關鍵技術：首先，利用計算機輔助精子分析系統（Computer-Assisted Sperm Analysis, CASA）精確評估精子動力學參數；其次，采用低滲腫脹試驗（Hypotonic Swelling Test, HOST）和FITC-PSA熒光染色分別檢測精子細胞膜和頂體膜的完整性；再者，使用JC-1熒光探針通過流式細胞術分析精子線粒體膜電位（Mitochondrial Membrane Potential, ΔΨm）；最后，通過共聚焦熒光顯微鏡和流式細胞術定量分析Cy-3標記的外源DNA被精子攝取的效率。實驗樣本為從6只成年江西康樂公雞采集并經質量篩選后的混合精液。
Effect of pulse voltage on sperm-related parameters
研究人員首先探討了脈沖電壓（0-300 V）對精子相關參數的影響。結果顯示，隨著電壓升高，精子總活力、前向運動力、曲線運動速度（VCL）、平均路徑速度（VAP）、直線運動速度（VSL）以及細胞膜完整性均顯著下降（P < 0.05）。頂體完整性和線粒體膜電位也呈輕微下降趨勢。值得注意的是，當電壓設置為100 V時，精子對外源DNA的攝取效率最高，接近60%。而當電壓達到300 V時，精子活力和功能出現明顯受損。
Effect of the number of electrical pulses on sperm-related parameters
在確定最佳電壓（100 V）后，研究人員進一步優化了電脈沖次數（0-10次）。結果表明，隨著脈沖次數增加，精子總活力和細胞膜完整性顯著降低（P < 0.05），而前向運動力、頂體完整性和線粒體膜電位僅有輕微下降。當脈沖次數為5次時，外源DNA攝取效率達到峰值（近60%）。脈沖次數增至10次時，VAP和VSL出現極顯著下降（P < 0.01）。
Effect of electrical pulse duration on sperm-related parameters
最后，研究人員優化了電脈沖持續時間（0-50 ms）。研究發現，隨著脈沖時長增加，精子總活力、前向運動力、細胞膜完整性和VCL顯著降低（P < 0.05）。當脈沖時長為5 ms時，外源DNA攝取效率最高，接近60%。其他運動學參數則相對穩定。
Determination of the optimal electroporation conditions for chicken sperm
通過系統優化，研究最終確定了江西康樂雞精子的最佳電穿孔條件：電壓100 V，脈沖次數5次，脈沖時長5 ms。在此優化條件下，精子外源DNA攝取效率達到57.1%。與未電穿孔的陰性對照組相比，與受精能力密切相關的關鍵參數，包括精子前向運動力、頂體完整性和線粒體膜電位，均未發生顯著變化；僅有精子總活力和細胞膜完整性出現顯著但程度有限的下降（P < 0.05）。這表明優化后的電穿孔條件對精子功能造成的損傷最小，能夠較好地維持其受精潛力。
在討論部分，研究人員深入分析了電穿孔參數（電壓、脈沖數、脈沖時長）與轉染效率及細胞損傷之間的關系。他們指出，轉染效率與這些參數在一定范圍內呈正相關，但超過臨界值（本研究確定為100 V, 5脈沖, 5 ms）后，DNA攝取效率和細胞存活率均會下降，這與其他物種（如牛、豬、斑馬魚）及不同類型細胞的研究結果一致。其內在機制可能與高電壓導致不可逆電穿孔、脈沖持續時間過長引起電極杯發熱、細胞膜脂質過氧化、膜蛋白損傷、細胞內鈣離子（Ca2+）穩態失衡、ATP耗竭以及活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）大量產生等因素有關。研究人員還比較了本研究結果與其他物種精子電穿孔研究的異同，并分析了可能的原因，如電穿孔系統類型的差異。他們提出，未來采用毛細管電穿孔（Capillary Electroporation）這一新技術，通過減小電極間距和反應體積，有望進一步提高雞精子的轉染效率和存活率。最后，研究人員展望了將本研究優化的STAGE技術與高效ssDNA插入-CRISPR（Easi-CRISPR）基因編輯技術相結合的應用前景。這種組合策略有望在單代內獲得雙等位基因插入的基因編輯家禽，從而極大地節省時間和成本，加速家禽育種進程，對全球家禽產業具有重大意義。
綜上所述，本研究成功優化了江西康樂雞精子的電穿孔條件，在獲得較高外源DNA轉染效率（57.1%）的同時，最大限度地保護了精子的關鍵受精功能。這為后續應用精子轉染輔助基因編輯（STAGE）技術進行高效禽類基因編輯奠定了堅實的技術基礎，為克服傳統PGC途徑的局限性提供了新的解決方案，對推動家禽育種技術的發展具有重要意義。
