《Talanta》：CRISPR-Cas12a biosensing technology advances and applications in precision diagnostics and cancer research
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CRISPR-Cas12a技術兼具基因編輯與分子診斷功能，在核酸及非核酸檢測中展現高靈敏度和多場景適應性，其優化策略與集成化平臺發展推動臨床轉化。
臧子瑜|陳杰|董毅|陳琳琳|楊美華|穆美雅|周麗仁輝|張偉|鄒廣榮|劉超星
中山大學醫學院，中國廣東省深圳市，518107
摘要
CRISPR-Cas12a已成為一種多功能生物技術平臺，在生物傳感、診斷和精準基因組編輯領域具有重要的應用價值。該系統由一條crRNA激活，表現出對目標序列的特異性切割活性，并能識別可編程的PAM（Protospacer-Agouti-Motif）序列。這些特性為準確檢測多種生物標志物提供了堅實的基礎。其檢測能力涵蓋核酸目標（如病毒RNA和癌癥突變）以及非核酸分子（如外泌體和蛋白質）。最新進展表明，該系統具有多重溫度適應性、快速動力學特性，并且能夠同時處理DNA和RNA目標。技術改進包括利用機器學習輔助設計crRNA以提高預測準確性，以及開發出克服傳統PAM限制的工程化EnAsCas12a變體。值得注意的成就包括實現阿托摩爾級靈敏度的熵驅動電路、兼容智能手機的四通道定量檢測系統，以及可在30分鐘內完成的所有集成工作流程。傳感器設計的進步（如金屬有機框架封裝和高性能適配體傳感器）進一步擴展了其檢測能力。在腫瘤學研究中，CRISPR-Cas12a技術為全面分析腫瘤微環境（TME）中的復雜分子網絡提供了強大工具，并有助于超靈敏地檢測早期癌癥生物標志物。此外，在基因組編輯方面，CRISPR-Cas12a憑借獨特的修復途徑、多樣的遞送方式及高效的轉基因模型構建能力，擴展了其功能范圍，超越了傳統診斷應用。隨著持續發展，這項技術有望發展成為整合腫瘤微環境研究、即時癌癥診斷和可編程基因組工程的綜合性平臺，為生物醫學研究和臨床應用提供創新解決方案。
引言
CRISPR-Cas系統在細菌和古菌中作為一種適應性免疫機制，保護它們免受外來遺傳元素的侵害。該系統分為兩大類、六種類型和33個亞型[1]。I類CRISPR/Cas3系統在診斷領域表現出良好效果[2]，而V類Cas9則廣泛應用于基因編輯[3]。隨著CRISPR-Cas12a（最初稱為Cpf1）的發現與研究，它被歸類為V類系統的新成員[4]。2015年，Zetsche等人首次報道了來自Francisella novicida U112的Cas12a能夠通過crRNA引導進行質粒干擾，證實了其內切酶活性[5]。該系統由Cas12a蛋白、crRNA、PAM序列（通常為5′-TTTV-3′）、目標DNA及輔助因子組成，作為單一crRNA引導的內切酶發揮作用[4,6,7]。
Cas12a屬于一個包含至少46個非冗余同源物的蛋白質家族，例如AsCas12a（Acidaminococcus屬）、LbCas12a（Lachnospiraceae菌屬）和FnCas12a（Francisella novicida）[4,7]。其中，AsCas12a和LbCas12a在哺乳動物系統中的編輯效率最高。這兩種蛋白主要識別TTTV PAM序列，但也能結合CTTV和TCTV等變體[8, [9], [10]]。盡管LbCas12a體積較小，但其編輯效率更高且脫靶率高于AsCas12a。工程化的enAsCas12a顯著提升了催化活性[11,12]。最近發現的FnCas12a和hyperCas12a等變體進一步拓寬了其在病原體檢測和基因編輯中的應用潛力[13]。由于在核酸檢測和基因編輯方面的獨特優勢，Cas12a已成為生命科學研究中的關鍵工具。
結構與功能域
Cas12a蛋白具有雙葉結構。REC（RuvC-Nuclease Complex）葉包含REC1/REC2結構域，負責crRNA的結合；NUC（Nucleic Acid）葉包含RuvC（內切酶結構域）、PI（PAM識別結構域）、WED（穩定crRNA 5′端結構域）和BH（連接REC和NUC葉的結構域）[6,14,15]。RuvC內切酶結構域由RuvC I-III亞區組成，crRNA處理位點位于WED-III亞區[6,16,17]。
crRNA引導的目標識別與切割
crRNA包含一個保守的直接重復（DR）區域和一個可編程序列
利用CRISPR-Cas12a的切割活性進行精準基因編輯
Cas12a的切割活性使其成為基因編輯中的強大工具。具體而言，切割目標雙鏈DNA時會產生交錯的雙鏈末端（粘性末端），這有助于精確的DNA整合定向，特別有利于同源定向修復（HDR）。這些粘性末端增強了Cas12a的功能，使其能夠更有效地進行HDR和基因組整合CRISPR-Cas12a在核酸診斷中的應用
研究表明，CRISPR-Cas12a不僅具有切割活性，還具有轉錄切割（cis-cleavage）活性。這一特性顯著提升了其在核酸診斷中的應用效果。將CRISPR-Cas12a與核酸擴增、光解控制和級聯擴增技術結合，開發出了快速、靈敏的即時核酸診斷方法，有效檢測了DNA和RNA病毒及食物中的病原體CRISPR-Cas12a在非核酸診斷中的應用
除了核酸檢測外，CRISPR-Cas12a還成為非核酸診斷的多功能平臺。這一擴展基于將非核酸信號轉化為可激活的核酸觸發劑，并利用Cas12a的切割活性。應用范圍包括小分子、蛋白質、金屬離子、循環腫瘤細胞和抗生素的檢測[105]。
CRISPR-Cas12a系統的優化策略
深入研究CRISPR組分的詳細機制和調控特性，可顯著提升該技術的精確度、靈敏度和可編程性[124,125]。已有大量研究致力于優化這一系統。Cas12a蛋白吸引了大量研究關注，工程化改造引入了新的功能，例如光控激活[126]和擴展的目標序列識別能力CRISPR-Cas12a在腫瘤微環境分析及早期癌癥檢測中的應用
腫瘤微環境（TME）是一個復雜的生態系統，包含多種細胞類型、細胞外基質成分和信號分子，這些因素在腫瘤發生、進展和轉移中起關鍵作用[155]。TME的關鍵成分包括循環腫瘤DNA（ctDNA）、腫瘤來源的細胞外囊泡（EVs）、微小RNA（miRNAs）和多種腫瘤相關mRNAs。準確檢測這些生物標志物對早期癌癥診斷和治療監測至關重要展望
憑借出色的操作靈活性（如廣泛的溫度適應性、雙DNA/RNA特異性以及具有放寬PAM要求的工程化變體），CRISPR-Cas12a有望發展成為下一代綜合性診斷平臺。機器學習優化的crRNA、實現阿托摩爾級靈敏度的熵驅動電路以及一體化系統等關鍵技術將加速其臨床轉化。我們預計未來會出現集成在智能手機中的CRediT作者貢獻聲明臧子瑜：撰寫初稿、數據可視化、形式分析、概念構建。陳杰：撰寫初稿、驗證、方法設計、實驗設計、數據管理。董毅：撰寫初稿、驗證、方法設計、實驗設計、數據管理。陳琳琳：撰寫初稿、軟件開發、項目協調、方法設計、形式分析、數據管理。楊美華：審稿與編輯、撰寫初稿、項目協調利益沖突聲明
作者聲明不存在可能影響本文研究的已知財務利益或個人關系。
致謝
本工作得到了國家自然科學基金（22577165, 22307150）、廣東省基礎與應用基礎研究基金（2024A1515012319, 20230807110315032）以及深圳市科技創新計劃（JCYJ20240813150427036, JCYJ20230807110315032）的支持。
