Scissor+上皮細(xì)胞通過CCL20-CCR6軸與MDK信號(hào)通路重塑轉(zhuǎn)移微環(huán)境驅(qū)動(dòng)肝細(xì)胞癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的多組學(xué)圖譜
《Cellular Oncology》：Multi-omics profiling reveals that Scissor+ epithelial cells regulate intrahepatic metastasis of HCC via remodeling the metastatic microenvironment
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本研究針對(duì)肝細(xì)胞癌（HCC）肝內(nèi)轉(zhuǎn)移（IM）早期階段惡性上皮細(xì)胞異質(zhì)性機(jī)制不清的難題，通過整合單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）及機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，首次鑒定出與患者不良預(yù)后密切相關(guān)的Scissor+上皮細(xì)胞亞群。研究發(fā)現(xiàn)該亞群通過CCL20-CCR6軸招募CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）介導(dǎo)免疫抑制，并經(jīng)MDK-SDC2/MDK-NCL信號(hào)重塑BCAM+癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs），共同促進(jìn)血管生成與免疫逃逸。基于此構(gòu)建的Scissor+相關(guān)上皮評(píng)分（SRES）預(yù)后模型在TCGA、GSE14520和ICGC-LIRI隊(duì)列中顯著優(yōu)于39個(gè)已發(fā)表標(biāo)志物，為HCC早期轉(zhuǎn)移干預(yù)提供了新型靶點(diǎn)與精準(zhǔn)預(yù)測(cè)工具。
肝細(xì)胞癌（HCC）是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，五年相對(duì)生存率僅為18%，其預(yù)后差主要?dú)w因于高轉(zhuǎn)移率和術(shù)后復(fù)發(fā)。尤其值得關(guān)注的是，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移（IM）作為HCC最常見的轉(zhuǎn)移形式，常發(fā)生在診斷前，但受技術(shù)限制，IM在單細(xì)胞水平的異質(zhì)性特征尚不明確。腫瘤微環(huán)境（TME）在腫瘤進(jìn)展中扮演關(guān)鍵角色，其中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）型HCC呈現(xiàn)免疫荒漠特征，且癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）在早期轉(zhuǎn)移中的作用仍知之甚少。因此，揭示IM的細(xì)胞異質(zhì)性及其微環(huán)境重塑機(jī)制，對(duì)開發(fā)早期診斷生物標(biāo)志物和改善患者預(yù)后具有重要意義。
為解決上述問題，海軍軍醫(yī)大學(xué)朱文龍、范暢、姚佳利等人在《Cellular Oncology》發(fā)表研究，通過多組學(xué)整合分析揭示了Scissor+上皮細(xì)胞通過調(diào)控免疫和基質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)HCC肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的新機(jī)制。研究利用來(lái)自23例肝樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)（包括正常肝、原發(fā)腫瘤和IM組織），結(jié)合TCGA、GSE14520和ICGC-LIRI隊(duì)列的轉(zhuǎn)錄組與臨床數(shù)據(jù)，以及空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過Scissor算法識(shí)別表型相關(guān)細(xì)胞亞群，采用機(jī)器學(xué)習(xí)構(gòu)建預(yù)后模型，并利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵互作通路。
主要技術(shù)方法
研究整合多中心scRNA-seq數(shù)據(jù)（PRJCA007744和GSE115469數(shù)據(jù)集），采用Seurat進(jìn)行細(xì)胞聚類注釋，通過Scissor關(guān)聯(lián)表型識(shí)別Scissor+上皮細(xì)胞，利用Monocle和Slingshot擬時(shí)序分析細(xì)胞演化軌跡。細(xì)胞互作通過CellChat和NicheNet解析，預(yù)后模型基于MIME平臺(tái)整合101種機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選標(biāo)志基因。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證包括Western blot、RT-qPCR、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和多重免疫組化（mIHC）等。
3.1 肝內(nèi)轉(zhuǎn)移HCC微環(huán)境圖譜
研究通過對(duì)21,631個(gè)IM細(xì)胞、114,219個(gè)原發(fā)腫瘤（PT）細(xì)胞和5,978個(gè)正常肝（NC）細(xì)胞的分析，鑒定出8種主要細(xì)胞類型。Ro/e分析顯示，IM組織中CAFs、CD4+T細(xì)胞、CD4+Treg、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯著富集，而CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞比例下降，提示IM微環(huán)境呈免疫抑制特征。
3.2 上皮細(xì)胞異質(zhì)性及演化軌跡
上皮細(xì)胞被分為7個(gè)亞群，其中C3、C4、C5和C6在IM中富集，功能分析顯示C3高表達(dá)細(xì)胞周期相關(guān)基因，C4-C6富集EMT通路。擬時(shí)序分析表明，正常上皮細(xì)胞（C2）經(jīng)中間狀態(tài)向惡性亞群分化，CNV分析進(jìn)一步確認(rèn)C3-C6具有高惡性程度。
3.3 Scissor+上皮細(xì)胞促進(jìn)IM及其預(yù)后價(jià)值
Scissor+細(xì)胞主要富集于C3亞群，高表達(dá)AKR1C3、SPP1等促轉(zhuǎn)移基因。功能富集顯示Scissor+細(xì)胞活躍于糖酵解和NF-κB通路。生存分析表明，Scissor+特征與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。
3.4 機(jī)器學(xué)習(xí)揭示Scissor+上皮細(xì)胞基因的預(yù)后意義
通過MIME平臺(tái)篩選出SPP1、CTSA、CCT5、HSPA6、NDRG1和CCT6A六個(gè)基因構(gòu)建SRES預(yù)后模型。在多個(gè)隊(duì)列中，SRES-high患者總生存期顯著縮短，且模型預(yù)測(cè)性能優(yōu)于39個(gè)已發(fā)表標(biāo)志物。
3.5 SRES相關(guān)基因在IM中的驗(yàn)證
空間轉(zhuǎn)錄組和免疫組化驗(yàn)證SRES基因在IM組織中高表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，這些基因在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系（HCCLM3/MHCC97H）中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步支持其促轉(zhuǎn)移功能。
3.6 Scissor+上皮細(xì)胞通過重塑免疫微環(huán)境促進(jìn)IM
Scissor+細(xì)胞通過CCL20-CCR6軸招募CD4+Treg，誘導(dǎo)免疫抑制。mIHC證實(shí)兩者在IM組織中共定位，且相關(guān)患者預(yù)后較差。
3.7 Scissor+上皮細(xì)胞通過重塑CAFs促進(jìn)IM
BCAM+CAFs在IM中特異性富集，擬時(shí)序分析顯示其由CTHRC1+CAFs演化而來(lái)。CellChat分析發(fā)現(xiàn)Scissor+細(xì)胞通過MDK-SDC2/MDK-NCL信號(hào)與BCAM+CAFs互作，促進(jìn)血管生成。
3.8 Scissor+上皮細(xì)胞通過MDK信號(hào)招募并教育成纖維細(xì)胞
Transwell和Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Scissor+細(xì)胞條件培養(yǎng)基可招募LX-2成纖維細(xì)胞并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為BCAM+CAFs，而敲低MDK或受體SDC2/NCL可逆轉(zhuǎn)該過程。
結(jié)論與討論
本研究首次繪制了HCC肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的單細(xì)胞微環(huán)境圖譜，鑒定出Scissor+上皮細(xì)胞為關(guān)鍵促轉(zhuǎn)移亞群，并闡明其通過CCL20-CCR6軸招募CD4+Treg和經(jīng)MDK信號(hào)活化BCAM+CAFs的雙重機(jī)制。SRES預(yù)后模型為早期識(shí)別高危轉(zhuǎn)移患者提供了實(shí)用工具，而CCL20-CCR6和MDK信號(hào)通路可作為潛在治療靶點(diǎn)。未來(lái)研究需進(jìn)一步探索Scissor+細(xì)胞與微環(huán)境中其他組分（如內(nèi)皮細(xì)胞、髓系抑制細(xì)胞）的互作，以全面揭示轉(zhuǎn)移機(jī)制。
