《The Veterinary Journal》：Development and characterization of a recombinant attenuated duck adenovirus B2 vector expressing the
vp3 gene of short beak and dwarfism syndrome virus
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鴨腺病毒B2（DAdV-B2）和短喙侏儒綜合征病毒（SBDSV）是鴨產(chǎn)業(yè)的主要病原體，本研究通過連續(xù)傳代獲得非致病性DAdV-B2疫苗株BG18cm20，并利用CRISPR/Cas9技術(shù)在其基因組中插入GFP或SBDSV VP3基因，成功構(gòu)建重組腺病毒BG18cm20-GFP和BG18cm20-SBDSV-VP3。體外實驗表明重組病毒高效復(fù)制且表達穩(wěn)定，電鏡觀察證實VP3蛋白可自主組裝為病毒樣顆粒，驗證了BG18cm20作為安全有效的鴨用腺病毒載體平臺，為后續(xù)雙價疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
作者：広聚友、江丹丹、程曉霞、曾莉、肖世峰、朱曉莉、王紹、陳少英、陳世龍
中國福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350003
摘要
鴨腺病毒B2（DAdV-B2）和短喙矮小綜合征病毒（SBDSV）是全球鴨產(chǎn)業(yè)中造成嚴重經(jīng)濟損失的主要病原體。為了開發(fā)能夠表達SBDSV抗原的重組DAdV-B2病毒，我們首先通過連續(xù)傳代毒力強的BG18株病毒于麝香鴨胚胎成纖維細胞中，獲得了減毒的DAdV-B2株BG18cm20。致病性評估證實BG18cm20對麝香鴨雛鴨無毒，驗證了其作為病毒載體骨架的安全性。利用CRISPR/Cas9輔助的同源介導(dǎo)末端連接技術(shù)，我們將GFP報告基因或SBDSV的vp3基因插入BG18cm20的基因組位點（ORF20-ORF53），成功構(gòu)建了重組病毒BG18cm20-GFP和BG18cm20-SBDSV-VP3。體外實驗表明，這些重組病毒能夠高效復(fù)制，并在15次連續(xù)傳代后仍保持插入基因的穩(wěn)定表達。值得注意的是，透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)BG18cm20-SBDSV-VP3表達的VP3蛋白能夠自組裝成類似SBDSV的病毒顆粒。綜上所述，BG18cm20是一個安全有效的病毒載體平臺，可用于表達外源抗原。BG18cm20-SBDSV-VP3的構(gòu)建和體外特性研究為未來開發(fā)針對DAdV-B2和SBDSV的雙價疫苗奠定了基礎(chǔ)。
引言
鴨腺病毒B（DAdV-B）屬于腺病毒科（Adenoviridae）中的禽腺病毒屬（Aviadenovirus），是水禽的重要病原體（Chen等人，2022年）。DAdV-B是一種無包膜病毒，其二十面體衣殼包裹著約43 kb的雙鏈線性DNA基因組（Chen等人，2022年）。DAdV-B基因組編碼多種非結(jié)構(gòu)蛋白（如DNA聚合酶、52 K、100 K、22 K和ORF19）以及三種主要結(jié)構(gòu)蛋白：六鄰體蛋白、纖維蛋白和五鄰體蛋白，這些蛋白對病毒顆粒的組裝和感染性至關(guān)重要（Chen等人，2022年；Shi等人，2022年）。鴨腺病毒B包含兩種基因型，DAdV-2 GR代表基因型1（DAdV-B1），而在中國麝香鴨群中分離出的DAdV-3株屬于基因型2（DAdV-B2）（Chen等人，2022年）。DAdV-B1 GR最早于1982年在法國麝香鴨中分離鑒定（Bouquet等人，1982年；Marek等人，2014年）。自2014年以來，中國多個地區(qū)的鴨場報告了DAdV-B2的暴發(fā)，其特征是肝臟出現(xiàn)蒼白病變（Chen等人，2022年；Tan等人，2024年；Zhang等人，2016年）。感染后的鴨子表現(xiàn)出疲勞和突然死亡的癥狀，尸檢發(fā)現(xiàn)肝臟呈蒼白出血狀態(tài)（Chen等人，2022年）。該病毒感染導(dǎo)致受影響鴨群的發(fā)病率和死亡率分別為20–50%和10–50%，給產(chǎn)業(yè)帶來了重大經(jīng)濟損失（Chen等人，2022年；Zhang等人，2016年）。迄今為止，尚未開發(fā)出針對DAdV-B2的商業(yè)疫苗，這使得病毒在鴨場中持續(xù)傳播，并促使多種突變株的出現(xiàn)（Chu等人，2022年；Shi等人，2022年；Tan等人，2024年；Yin等人，2022年）。
短喙矮小綜合征病毒（SBDSV）是另一種新興的病毒病原體，近年來對鴨養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成了嚴重威脅（Chen等人，2016b；Soliman等人，2020年）。自2015年首次在中國報道以來，SBDSV迅速傳播到主要鴨生產(chǎn)地區(qū)（Chen等人，2016a；Chen等人，2016b）。該病毒具有廣泛的宿主嗜性，在商業(yè)肉用品種（如櫻桃谷鴨、北京鴨和騾鴨）中表現(xiàn)出特別的毒力，同時在中國主要家養(yǎng)水禽中仍具有致病潛力（Chen等人，2015年；Ning等人，2017年；Xiao等人，2017年）。SBDSV是一種新型的鵝細小病毒（GPV）變種，與經(jīng)典GPV分離株在基因上存在顯著差異，但在系統(tǒng)發(fā)育上與麝香鴨細小病毒（MDPV）的關(guān)系更密切（Chen等人，2016b）。SBDSV感染會導(dǎo)致嚴重的臨床癥狀，包括生長遲緩、喙短和骨骼畸形，從而導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化效率顯著降低和產(chǎn)量大幅下降（Chen等人，2016b；Xiao等人，2017年）。目前尚無針對SBDSV的商業(yè)疫苗，因此迫切需要開發(fā)預(yù)防SBDSV感染的疫苗。SBDSV的衣殼主要由VP1、VP2和VP3三種結(jié)構(gòu)蛋白組成（Liu等人，2024年）。其中，VP3是最豐富的蛋白，并已被確定為關(guān)鍵的保護性抗原（Wang等人，2024b）。它能夠在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)強烈的中和抗體反應(yīng)，使其成為SBDSV疫苗開發(fā)的理想靶點（Xiao等人，2022年）。
腺病毒因其獨特的優(yōu)勢而在人類和獸醫(yī)醫(yī)學領(lǐng)域成為有前景的疫苗載體：穩(wěn)定的二十面體衣殼結(jié)構(gòu)、在宿主細胞中的高效復(fù)制能力、易于基因操作以及較大的包裝能力（Portugal等人，2024年；Wang等人，2023年）。這些優(yōu)勢已通過針對埃博拉病毒（Zhu等人，2017年）、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）（Logunov等人，2021年）和非洲豬瘟病毒（ASFV）（Liu等人，2023年）等高致病性病原體的腺病毒載體疫苗的成功開發(fā)得到驗證，這些疫苗在臨床和田間應(yīng)用中均表現(xiàn)出強大的保護效果。在禽類研究中，腺病毒載體主要集中在禽腺病毒上，如FAdV-1、FAdV-4和FAdV-9等血清型被探索作為家禽疾病疫苗的潛在載體平臺（Deng等人，2013年；Francois等人，2004年；Guo等人，2023年；Pei等人，2018年）。然而，基于鴨腺病毒的研究相對有限，這阻礙了能夠同時保護鴨子免受多種病原體感染的多價疫苗的開發(fā)。
為了建立鴨腺病毒載體平臺，我們使用了通過連續(xù)細胞傳代獲得的減毒DAdV-B2株BG18cm20作為載體骨架。利用CRISPR/Cas9輔助的同源介導(dǎo)末端連接（HMEJ）基因編輯技術(shù)，我們構(gòu)建了表達GFP報告基因或SBDSV vp3基因的重組DAdV-B2載體。這些重組病毒在體外表現(xiàn)出高效復(fù)制，并保持插入基因的穩(wěn)定表達。重要的是，DAdV-B2-VP3重組病毒表達的VP3能夠自組裝成類似SBDSV的病毒顆粒。本研究為未來開發(fā)針對DAdV-B2和SBDSV的疫苗奠定了基礎(chǔ)，同時也展示了鴨腺病毒作為多價疫苗平臺的潛力。
細胞、病毒和抗體
Leghorn雄性肝癌（LMH）細胞系來自美國典型培養(yǎng)物收藏中心（ATCC）。初級麝香鴨胚胎成纖維（MDEF）細胞是從11天大的麝香鴨胚胎中制備的。LMH和MDEF細胞均在含有10%胎牛血清（FBS；Gibco）的Dulbecco改良鷹培養(yǎng)基（DMEM；Gibco）中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C和5% CO2的培養(yǎng)箱。鴨腺病毒B2株BG18最初是在我們的實驗室中分離的（Chen等人，2022年）。BG18cm20株
通過連續(xù)細胞傳代生成減毒的鴨腺病毒B2株
開發(fā)安全的減毒鴨腺病毒株對于其作為病毒載體的應(yīng)用至關(guān)重要。為了獲得無毒的DAdV-B2株，我們將毒力強的BG18株在MDEF細胞中進行了總共160次連續(xù)傳代。經(jīng)過120次傳代后，成功獲得了無毒的BG18cm20株（圖1A）。為了評估BG18cm20的減毒效果，我們對3天大的麝香鴨雛鴨進行了肌肉注射
討論
病毒載體疫苗是一個有前景的平臺，可以在一次免疫中傳遞多種異源抗原，提供多重保護（Wang等人，2023年），它們能夠誘導(dǎo)全面的體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫，這使得它們在傳統(tǒng)滅活疫苗或亞單位疫苗難以引發(fā)強烈免疫反應(yīng)的禽類疾病控制中特別有價值（Wang等人，2024a）。在禽類疫苗載體中，新城疫病毒（NDV）和火雞皰疹病毒
CRediT作者貢獻聲明
廣聚友：撰寫 – 原始草稿、驗證、項目管理、方法學、研究、資金獲取、數(shù)據(jù)分析、概念化。
江丹丹：方法學、研究。
程曉霞：方法學。
曾莉：方法學。
肖世峰：方法學。
朱曉莉：方法學。
王紹：方法學。
陳少英：撰寫 – 審稿與編輯、監(jiān)督、資源協(xié)調(diào)、研究、資金獲取。
陳世龍：撰寫 – 審稿與編輯。
倫理聲明
本研究中使用的動物實驗方案已獲得中國福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物護理和使用委員會的批準。實驗操作遵循了批準的指南（批準編號：MYLISC2025–055）。
關(guān)于寫作過程中使用生成式AI和AI輔助技術(shù)的聲明
在準備本工作時，作者使用了Youdao翻譯工具來翻譯部分文本。使用該工具后，作者對內(nèi)容進行了必要的審查和編輯，并對出版物的內(nèi)容負全責。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文報告工作的財務(wù)利益或個人關(guān)系。
致謝
本工作得到了中國福建省農(nóng)業(yè)科學院的項目（ZYTS202421、DWHZ2024–21）、福建省公益項目（2025R1073）以及福建省農(nóng)業(yè)科學院的“5511”協(xié)同創(chuàng)新項目（XTCXGC2021018和XTCXGC2021012）的支持。
