《Aquatic Toxicology》：Zebrafish Abcg2a mutant line as an
in vivo model for evaluation of the interaction of Abcg2a with drugs and contaminants
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ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在生物體中起到轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒的關(guān)鍵作用，本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建zebrafish Abcg2a突變體，驗證其作為毒理學(xué)和藥理學(xué)模型的可靠性。突變體在胚胎發(fā)育至成體階段均未出現(xiàn)表型異常，但基因表達(dá)量下降超90%，熒光底物pheophorbide A的分布模式與野生型存在顯著差異。在MLN7243和mitoxantrone毒性測試中，突變體幼魚存活率顯著降低，且加入抑制劑Ko143后野生型幼魚死亡率與突變體相當(dāng)，證實Abcg2a對藥物和毒物轉(zhuǎn)運(yùn)的必要性。
Jovica Lon?ar | Roko ?aja | Ivan Mihaljevi? | Jelena Dragojevi? Vi?evi? | Lana Vujica | Marin Kutnjak | Cecile Otten | Tvrtko Smital
分子生態(tài)毒理學(xué)實驗室，魯杰爾·博斯科維奇研究所（Rudjer Bo?kovi? Institute）海洋與環(huán)境研究部門，地址：Bijeni?ka 54，10000，薩格勒布，克羅地亞
摘要
作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的成員，ABCG2是一種半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠介導(dǎo)各種外源性底物穿過細(xì)胞膜的過程，在細(xì)胞解毒中起著關(guān)鍵作用。為了開發(fā)一個可靠的體內(nèi)模型來研究ABCG2及其與藥物和環(huán)境污染物之間的相互作用，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建了一種斑馬魚（Danio rerio）的Abcg2a突變體品系。這些Abcg2a突變體能夠正常發(fā)育至成年，且沒有可見的表型變化。在受精后5天內(nèi)，突變體幼魚的abcg2a基因表達(dá)減少了90%以上，并且在監(jiān)測的8個基因中有3個基因的功能相關(guān)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)增加。特定熒光底物pheophorbide A在突變體和野生型之間的積累模式有所不同，突變體主要在膽囊中積累，而野生型主要在腸道中積累。當(dāng)暴露于模型毒素MLN7243和mitoxantrone時，突變體幼魚的死亡率高于野生型。添加特定抑制劑Ko143后，野生型幼魚的死亡率上升至與突變體相同，表明Abcg2a的保護(hù)作用被消除。所創(chuàng)建的Abcg2a突變體品系可作為藥理學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)中的可靠體內(nèi)模型，進(jìn)一步闡明Abcg2a在不同組織和細(xì)胞區(qū)室中的功能及其與不同生理或外源性化合物的相互作用。
引言
ATP結(jié)合盒（ABC）膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在于動物組織中，這些組織構(gòu)成了吸收的外界（皮膚）或內(nèi)部邊界（腸道）、參與排泄的組織（肝臟、腎臟），或是血-組織屏障（血-腦、血-睪丸、血-胎盤屏障）。在這些部位，它們限制了外源性物質(zhì)的進(jìn)入和分布，并參與其排泄。人類中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族包含48個成員，分為7個亞家族。參與轉(zhuǎn)運(yùn)外源性物質(zhì)、藥物和環(huán)境污染物的成員蛋白屬于B、C和G亞家族。所有成員都至少具有一個核苷酸結(jié)合域（NBD），并根據(jù)NBD的序列保守性進(jìn)行分類（Annilo等人，2006年）。B亞家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含有兩個NBD和兩個跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD），因此是完整的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；C亞家族的一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還包含一個額外的TMD；G亞家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白僅含有一個NBD和一個TMD，以N'-C'方向排列，屬于半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sarkadi等人，2020年；Dean等人，2022年）。
ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有廣泛的底物選擇性，并且底物之間存在較高的重疊性。一般來說，ABCB1（通透性糖蛋白，P-gp）轉(zhuǎn)運(yùn)不帶電荷且呈中性的兩親性化合物；ABCC1-C3（多藥耐藥相關(guān)蛋白，MRPs）轉(zhuǎn)運(yùn)有機(jī)陰離子，包括與谷胱甘肽（GSH）結(jié)合的生物轉(zhuǎn)化代謝物、葡萄糖醛酸和硫酸鹽。然而，ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（乳腺癌耐藥蛋白，BCRP）能夠轉(zhuǎn)運(yùn)ABCB1和ABCC的底物。ABCG2的底物包括蒽環(huán)類藥物（如多柔比星）、蒽醌類藥物（如mitoxantrone）、表鬼臼毒素（如etoposide）、酪氨酸激酶抑制劑（如imatinib、sunitinib和nilotinib）、葉綠素降解產(chǎn)物（如pheophorbide A，PhA）、喹啉生物堿（如topotecan和irinotecan），以及生理底物（如卟啉前體、尿酸鹽、類固醇（膽固醇、E3S）和葉酸）。與大多數(shù)同時被ABCB1和ABCC1-3轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物不同，PhA已被證明是ABCG2的特異性底物。因此，開發(fā)了一種熒光測定方法用于體外（Robey等人，2004年）和體內(nèi)（Yasuda等人，2018年）檢測ABCG2的活性。
目前，關(guān)于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在脊椎動物和無脊椎動物中保護(hù)作用的大部分證據(jù)都支持ABCB1、ABCC1-3和ABCG2的作用，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已在原代細(xì)胞培養(yǎng)和癌細(xì)胞系中顯示出對外源性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。此外，還使用了各種野生型（WT）和突變體模型生物（小鼠、大鼠、魚類）進(jìn)行了體內(nèi)研究。此外，位于肝細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞頂端的ABCB11轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并未直接參與外源性物質(zhì)的清除，但它對膽汁分泌和腸肝循環(huán)過程至關(guān)重要，而這些過程對某些ABCG2底物的分布和清除至關(guān)重要（Henkel等人，2013年；Nayagam等人，2020年；Bieczynski等人，2021年）。
與哺乳動物相比，硬骨魚類經(jīng)歷了整個基因組的額外復(fù)制，因此它們通常擁有多個在人類中僅以單個基因形式存在的基因。ABCG2在鱒魚中有兩個同源基因（Abcg2a和d），而在斑馬魚中有四個（Abcg2a、b、c和d）。研究表明，Abcg2a在鱒魚（Zaja等人，2016年）和斑馬魚（Thomas等人，2024b）中都是人類ABCG2的功能性同源物，并且在血-腦屏障中的定位也相似。
也觀察到了一些基因的丟失，例如ABCB1在斑馬魚中不存在，其功能由abcb4和部分由abcb5承擔(dān)（Fischer等人，2013年）。盡管存在上述差異，斑馬魚仍擁有超過70%的人類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同源基因，再加上其他特性（如體型小、繁殖能力強(qiáng)、發(fā)育迅速和胚胎透明），使其成為研究膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的理想模型，無論是在生物醫(yī)學(xué)藥物研究還是環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域（Ferreira等人，2014年；Luckenbach等人，2014年；Hotz等人，2021年；Thomas等人，2024a）。
魚類中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能已在體內(nèi)（胚胎、幼魚、成魚）和各種體外模型（原代細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞系、分離的腎近端小管、分離的腦毛細(xì)血管、膜囊泡）中得到研究。然而，使用魚胚胎進(jìn)行的形態(tài)學(xué)敲低研究相對較少（Fischer等人，2013年），并且開發(fā)的突變體魚品系也非常有限（Park等人，2023年；Ellis等人，2018年；Tian等人，2017年；Pham等人，2021年）。為了解決這一研究空白，本研究重點開發(fā)并表征了一種缺乏ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能同源物的斑馬魚突變體品系，該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，在脊椎動物和無脊椎動物中在分子結(jié)構(gòu)和功能上都具有進(jìn)化保守性（Robey等人，2009年；Sarkadi等人，2020年；Dean等人，2022年；Thomas等人，2024b）。
由于Abcg2a的序列同源性最高（61%），且在功能上與人類ABCG2最為相似（Thomas等人，2024b），本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建并表征了一種斑馬魚突變體品系。人類和斑馬魚的ABCG2/Abcg2a同源物在胃腸道和血-腦屏障中均高度表達(dá)，能夠降低外源性物質(zhì)的生物利用度和分布，因此推測Abcg2a突變體在接觸外來化學(xué)物質(zhì)時會更敏感。這些突變體能夠正常發(fā)育至成年，且沒有可見的表型變化。在突變體幼魚中，abcg2基因的表達(dá)減少了90%以上，大多數(shù)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄也受到抑制，且野生型與突變體幼魚在特定熒光底物的轉(zhuǎn)運(yùn)方面存在顯著差異。此外，暴露于模型毒素MLN7243和mitoxantrone時，突變體幼魚的死亡率增加，而添加特定抑制劑Ko143后，野生型幼魚的死亡率上升至與突變體相同。
倫理聲明
本研究獲得了魯杰爾·博斯科維奇研究所倫理委員會、克羅地亞薩格勒布國家動物福利委員會和農(nóng)業(yè)部的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號525-10/124,120–9），并遵循了2010年9月歐洲議會和理事會關(guān)于用于科學(xué)目的的動物保護(hù)的指令（2010/63/EU）進(jìn)行。
化學(xué)品
所有化學(xué)品均購自Sigma–Aldrich（德國Taufkirchen）或Alfa Aesar（美國馬薩諸塞州Ward Hill）
Abcg2a突變斑馬魚品系的生成與驗證
我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，針對abcg2a基因的第4外顯子（ENSDARG00000100075）設(shè)計了gRNA，從而生成了含有移碼突變的斑馬魚Abcg2a突變體品系（圖1A和1B），該突變導(dǎo)致無義密碼子和翻譯提前終止（圖1B）。通過測序確認(rèn)了F3代中abcg2a突變體的成功生成，結(jié)果顯示abcg2a基因組位置14512–14513處有兩個核苷酸（TC）缺失。
討論
由于脊椎動物的基因通常具有高度保守性（Chan等人，2009年），且斑馬魚胚胎發(fā)育迅速（Kimmel等人，1995年），因此它們被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)（Goldsmith和Jobin，2012年；Anticevic等人，2023年）和生態(tài)毒理學(xué)（Fan等人，2021年；Vujica等人，2024年）領(lǐng)域，因為它們允許對具有功能性器官的胚胎進(jìn)行中等（Bieczynski等人，2020年；Gong等人，2025年）和高通量（Spomer等人，2012年；Grasse等人，2024年）的化學(xué)物質(zhì)篩選。斑馬魚
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
J. Lon?ar：概念化、數(shù)據(jù)整理、數(shù)據(jù)分析、研究方法、驗證、撰寫——初稿。R. ?aja：概念化、研究方法、撰寫——審閱與編輯。I. Mihaljevi?：數(shù)據(jù)整理、數(shù)據(jù)分析、撰寫——初稿。J. Dragojevi?：數(shù)據(jù)整理、數(shù)據(jù)分析、研究方法。L. Vujica：數(shù)據(jù)整理、數(shù)據(jù)分析、研究方法、撰寫——審閱與編輯。M. Kutnjak：數(shù)據(jù)整理、數(shù)據(jù)分析、研究方法。
未引用的參考文獻(xiàn)
(Mao和Unadkat，2015年；Schulz等人，2023年；van Wijk等人，2019年；White等人，2017年)
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
Jovica Lon?ar：撰寫——初稿、驗證、研究方法、數(shù)據(jù)分析、概念化。
Roko ?aja：撰寫——審閱與編輯、研究方法、概念化。
Ivan Mihaljevi?：撰寫——初稿、數(shù)據(jù)分析。
Jelena Dragojevi? Vi?evi?：研究方法、數(shù)據(jù)分析。
Lana Vujica：撰寫——審閱與編輯、研究方法、數(shù)據(jù)分析。
Marin Kutnjak：撰寫——初稿
