《Frontiers in Immunology》：Challenges of monocyte HLA-DR targeted immunomodulation in sepsis—a prospective observational cohort study
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本前瞻性隊列研究深入探討了膿毒癥中單核細胞人類白細胞抗原-DR（HLA-DR）表達降低的復(fù)雜機制。研究發(fā)現(xiàn)，該現(xiàn)象并非孤立存在，而是涉及抗原呈遞、共刺激、細胞因子產(chǎn)生及吞噬作用等多條通路的廣泛功能失調(diào)。盡管γ-干擾素（IFN-γ）體外刺激可部分恢復(fù)相關(guān)蛋白表達，但其水平仍顯著低于健康對照，且單核細胞表型標志物隨時間演變不一致，揭示了以HLA-DR為靶點的免疫調(diào)節(jié)療法療效有限的深層原因，強調(diào)了未來需基于更深入的機制理解和患者分層進行個性化治療。
引言
膿毒癥是一種由宿主對感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙，是全球主要的死亡原因之一。單核細胞表面人類白細胞抗原-DR（HLA-DR）的表達降低是膿毒癥免疫抑制的一個公認標志，與繼發(fā)感染和死亡風險增加相關(guān)。盡管使用干擾素-γ（IFN-γ）等療法旨在恢復(fù)單核細胞HLA-DR和免疫功能，但并未能一致改善臨床結(jié)局。因此，本研究通過一系列迭代實驗，重新審視當前理解的核心假設(shè)并彌補關(guān)鍵知識空白。
材料與方法
研究設(shè)計為一項前瞻性觀察性隊列研究，納入了55名入住重癥監(jiān)護病房（ICU）的膿毒癥患者（死亡率36%）和16名健康志愿者。采用流式細胞術(shù)評估單核細胞表型，脂多糖（LPS）刺激用于評估單核細胞功能容量。研究了經(jīng)典單核細胞通路，并識別那些對LPS刺激和/或體外IFN-γ調(diào)制有反應(yīng)的通路。同時，在健康志愿者皮內(nèi)注射紫外線滅活的大腸桿菌后，評估了外周血和炎癥組織中單核細胞HLA-DR的表達動態(tài)。
結(jié)果
臨床數(shù)據(jù)與單核細胞表型
與非幸存者相比，幸存者的入院序貫器官衰竭評估（SOFA）評分顯著更高。在基線水平，ICU患者的單核細胞HLA-DR、CD86、IL-10表達水平和吞噬能力均低于健康志愿者，而CD80和IL-1β水平升高。在所有標記物中，只有單核細胞HLA-DR表達能區(qū)分ICU幸存者和非幸存者。血清細胞因子分析顯示，ICU患者的IL-10和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平均高于健康對照，而IL-1β僅在非幸存者中升高。
在5天的觀察期內(nèi)，幸存者和非幸存者的單核細胞表型標志物演變不一致。單核細胞HLA-DR和CD86表達隨時間推移在兩組中均有所增加，接近健康志愿者水平。相反，單核細胞IL-10和吞噬能力在兩組中均進一步下降，而CD80持續(xù)上升。單核細胞IL-1β水平在整個研究期間保持不變。盡管幸存者和非幸存者的HLA-DR增長率相似，但幸存者在5天內(nèi)的HLA-DR表達始終較高。
對LPS的動態(tài)反應(yīng)
全血LPS刺激后，僅在ICU幸存者中觀察到血清IL-1β增加；在健康志愿者和ICU幸存者中觀察到IL-10增加；在所有三組中均觀察到TNF-α增加。然而，在外周血單核細胞（PBMC）與LPS孵育后，僅在ICU非幸存者中觀察到單核細胞IL-1β增加，而僅在健康志愿者中觀察到單核細胞TNF-α增加。血清和細胞內(nèi)細胞因子水平之間無顯著相關(guān)性。
單核細胞表面HLA-DR在體外吞噬后的內(nèi)化
吞噬作用發(fā)生后，健康志愿者的單核細胞表面HLA-DR表達無變化，但ICU患者的表達顯著降低。共聚焦成像顯示，在健康志愿者單核細胞中，吞噬作用導(dǎo)致表面HLA-DR和CD14內(nèi)化。與健康志愿者相比，ICU患者單核細胞在吞噬前基線水平的內(nèi)化HLA-DR比例更高，并且在吞噬后無明顯變化。
單核細胞HLA-DR表達降低與經(jīng)典功能標記物的廣泛缺陷相關(guān)
與健康志愿者相比，ICU膿毒癥患者的單核細胞在抗原呈遞途徑（HLA-DR, HLA-DP, CD74）、共刺激（CD86）、細胞因子（TNF-α, IL-10）、NOX-2和核因子κB（NF-κB p65）相關(guān)蛋白的表達上均顯著降低。而MHC II類反式激活因子（CIITA）、CD80、Toll樣受體4（TLR4/CD284）和Fc受體（CD64）的表達則更高。主成分分析顯示健康志愿者和ICU患者的單核細胞可以區(qū)分，抗原呈遞和共刺激相關(guān)蛋白是主要區(qū)分因素。
單核細胞對LPS和IFN-γ的反應(yīng)評估
ICU患者的單核細胞對體外LPS刺激反應(yīng)微弱，但IFN-γ處理可改善其反應(yīng)。IFN-γ處理增加了ICU患者單核細胞中抗原處理和呈遞相關(guān)蛋白（包括HLA-DR）的水平，但其表達仍顯著低于健康志愿者單核細胞。LPS和IFN-γ聯(lián)合刺激可增加健康志愿者和ICU患者單核細胞的HLA-DR表達，但ICU患者單核細胞中多種蛋白的表達水平仍顯著較低。同時，程序性死亡配體1（PD-L1/CD274）的表達在刺激后增加。
外周血和組織單核細胞HLA-DR表達的時間動態(tài)
在健康志愿者皮內(nèi)注射紫外線滅活的大腸桿菌后，外周血單核細胞HLA-DR在4小時和24小時均較基線顯著降低。然而，水皰液單核細胞HLA-DR在4小時至24小時顯著增加，并且在4小時和24小時均顯著高于外周血單核細胞水平。外周血和水皰單核細胞HLA-DR在24小時呈顯著正相關(guān)，但在4小時無相關(guān)性。
討論
本研究證實了單核細胞HLA-DR作為膿毒癥預(yù)后生物標志物的價值，并提出了若干新發(fā)現(xiàn)。單核細胞表型標志物隨時間演變不一致，凸顯了使用單一標志物作為預(yù)后或治療指標的局限性。動態(tài)功能測試顯示LPS誘導(dǎo)的細胞因子釋放不能預(yù)測ICU生存，且血清與細胞內(nèi)細胞因子無相關(guān)性。細菌吞噬后受損的細胞內(nèi)膜運輸是膿毒癥表面HLA-DR表達降低的一個機制。雖然IFN-γ能部分恢復(fù)單核細胞功能蛋白表達，但無法達到健康水平，且患者反應(yīng)存在異質(zhì)性，支持了基于生物標志物（如HLA-DR）進行患者分層以進行個性化治療的必要性。研究還揭示了膿毒癥中外周血與炎癥組織單核細胞表型存在區(qū)室化差異。總之，膿毒癥中單核細胞HLA-DR表達降低反映了多通路的廣泛破壞，限制了治療干預(yù)的效果。需要進一步了解單核細胞HLA-DR和免疫功能治療調(diào)節(jié)的機制，以識別最有可能從干預(yù)中受益的患者。
