《Frontiers in Immunology》：Transplanted gene-modified placental cells boost FVIII activity in pediatric sheep without eliciting immunity, toxicity, or adverse events
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本綜述重點探討了通過移植表達(dá)密碼子優(yōu)化、生物工程化人/豬雜交FVIII（ET3）的基因修飾人胎盤細(xì)胞（PLC-mcoET3），在幼年綿羊模型中實現(xiàn)持久提升血漿FVIII活性，同時成功避免引發(fā)抗FVIII/ET3中和抗體（抑制劑）的免疫反應(yīng)。研究對比了直接輸注純化ET3或全長重組人FVIII（hFVIII）蛋白會誘發(fā)高滴度抑制劑，而靜脈注射PLC-mcoET3則展現(xiàn)出良好的安全性和耐受性，為血友病A（HA）的細(xì)胞療法提供了新思路，并深入揭示了其潛在的免疫耐受機制。
背景
血友病A（HA）是一種由F8基因突變導(dǎo)致因子VIII（FVIII）缺乏的X連鎖遺傳性出血性疾病。當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理包括FVIII替代蛋白、工程化凝血因子以及抗體和基因療法等新型治療。這些療法雖能顯著改善患者預(yù)期壽命，但疾病負(fù)擔(dān)依然沉重，約30%的患者會發(fā)展出抗FVIII中和抗體（FVIII抑制劑），使替代療法失效并顯著增加發(fā)病和死亡風(fēng)險。艾美珠單抗（emicizumab）等非因子療法雖能有效預(yù)防出血，但對創(chuàng)傷和手術(shù)的管理仍需額外治療，且突破性出血仍時有發(fā)生。因此，亟需能夠提供長效治療且不誘發(fā)抑制劑的新療法。
目的
本研究旨在測試經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、編碼密碼子優(yōu)化生物工程化FVIII轉(zhuǎn)基因（mcoET3）的人胎盤細(xì)胞（PLC-mcoET3），在移植到幼年大型動物（綿羊）后提升血漿FVIII活性水平的能力。同時，評估該療法是否會誘導(dǎo)抑制劑形成，并明確其與直接輸注純化人FVIII（hFVIII）或ET3蛋白所引發(fā)的免疫反應(yīng)差異。
方法
研究選用8-12月齡（相當(dāng)于人類12-18歲）的幼年綿羊。實驗組每周靜脈（IV）或腹腔（IP）注射PLC-mcoET3，劑量為每次20 IU ET3/kg，連續(xù)3周（IV）或單次注射等效總劑量（IP）。對照組則接受相同劑量（20 IU/kg/周，連續(xù)5周）的純化重組ET3蛋白或臨床級全長重組hFVIII蛋白（Kogenate?FS）。監(jiān)測指標(biāo)包括血漿FVIII活性（通過一期APTT法測定）、抗FVIII/ET3體液免疫（IgM/IgG ELISA，Bethesda法測定抑制劑）和細(xì)胞免疫反應(yīng)（ELISpot檢測IFN-γ、IL-4，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)MLR），以及利用定制納米串（NanoString）基因表達(dá)面板（165個免疫相關(guān)基因）評估免疫反應(yīng)。通過數(shù)字PCR（dPCR）和RT-qPCR檢測組織中人細(xì)胞植活情況，并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
結(jié)果與結(jié)論
直接靜脈輸注純化ET3或hFVIII蛋白的綿羊均在短期內(nèi)（2-3周）產(chǎn)生了高滴度的抗ET3/FVIII IgG抑制劑抗體（最高達(dá)217 BU/mL），且抗體間存在交叉反應(yīng)。相比之下，靜脈注射PLC-mcoET3的動物，其血漿FVIII活性在至少15周內(nèi)持續(xù)升高，且未檢測到抗ET3/FVIII的IgG抗體或抑制劑。腹腔注射PLC-mcoET3的結(jié)果存在個體差異：三分之一的動物FVIII活性顯著持久提升且無抗體產(chǎn)生，另兩只動物則出現(xiàn)了短暫的低滴度（1 BU）抑制劑，但抗體水平和持續(xù)時間遠(yuǎn)低于蛋白輸注組。
細(xì)胞免疫方面，ELISpot未在任何處理組（包括蛋白輸注和細(xì)胞移植）中檢測到ET3特異性Th1（IFN-γ）或Th2（IL-4）細(xì)胞反應(yīng)。MLR和Luminex檢測表明，無論是IV還是IP途徑，PLC-mcoET3均未引發(fā)針對供體細(xì)胞的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)或抗HLA抗體。所有接受細(xì)胞治療的動物肝酶（ALT, AST）和白細(xì)胞計數(shù)均在正常范圍內(nèi)，組織病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)與治療相關(guān)的毒性或腫瘤形成。
植活分析顯示，IV和IP給藥的PLC-mcoET3能在綿羊的肝臟、肺、脾臟和胸腺等組織中長期（最長18個月）存留。納米串基因表達(dá)分析揭示了關(guān)鍵的免疫差異：與輸注hFVIII/ET3蛋白組相比，靜脈接受PLC-mcoET3的動物，其外周血單核細(xì)胞（PBMC）中與免疫激活相關(guān)的基因（如HIF1α、AHR、CD80/CD86、TLR4、ICOS及其調(diào)控因子IKZF2、NFATC1）表達(dá)顯著下調(diào)，而與免疫耐受相關(guān)的通路可能受到調(diào)控。此外，對PLC-mcoET3分泌的外泌體進(jìn)行RNA測序發(fā)現(xiàn)，其含有多種與誘導(dǎo)免疫耐受相關(guān)的mRNA轉(zhuǎn)錄本，如TGF-β、CTLA-4、IL-10、IL-27、PD-1、HMOX-1、IDO1以及HLA-E、HLA-F、HLA-G等。
在針對已存在抑制劑（由前期蛋白輸注誘導(dǎo)）的動物進(jìn)行PLC-mcoET3治療后，雖然部分動物抑制劑滴度有所升高，但三分之二的動物血漿FVIII活性仍得到提升，且組織中檢測到植活的人細(xì)胞。
討論
本研究證實，利用人胎盤細(xì)胞作為遞送載體，能夠安全有效地在幼年動物體內(nèi)實現(xiàn)長效FVIII表達(dá)，并成功規(guī)避了對異源FVIII分子（ET3）的劇烈體液免疫反應(yīng)。這種“細(xì)胞工廠”式的遞送策略與直接輸注蛋白的免疫原性形成鮮明對比。其潛在機制可能涉及PLC固有的免疫調(diào)節(jié)特性、其分泌的vWF對FVIII的免疫保護(hù)作用、移植細(xì)胞在組織中的特定分布模式以及其所分泌外泌體中耐受相關(guān)分子的共同作用，從而導(dǎo)致了一個偏向耐受而非免疫激活的局部微環(huán)境�；虮磉_(dá)譜的差異為理解這種免疫逃逸提供了重要線索。盡管在已致敏動物中效果有限，但該細(xì)胞療法為血友病A，尤其是抑制劑高風(fēng)險患者，提供了一種極具前景的治療新途徑。未來的研究將致力于在HA動物模型中進(jìn)行驗證，并進(jìn)一步闡明其精確的免疫調(diào)節(jié)機制。
