背景

寨卡病毒（ZIKV）是一種單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科，1947年首次從烏干達的恒河猴中分離得到。在發現后的數十年間，ZIKV感染僅見零星報道，多數病例表現為自限性發熱性疾病，未能引起對其臨床危害的廣泛關注。直到2015–2016年中南美洲大規模疫情暴發，ZIKV首次被證實可誘發嚴重神經系統疾病，包括吉蘭–巴雷綜合征（GBS）、先天性小頭畸形和腦膜腦炎，這使其公共衛生威脅被重新認識。然而，迄今為止，尚無獲批的ZIKV治療藥物或預防疫苗，防控措施的突破迫在眉睫。

闡明宿主–病毒相互作用，包括ZIKV復制機制、涉及的宿主因子以及關鍵宿主抗病毒免疫分子的作用通路，是制定有效防控策略的核心科學基礎。在病毒感染早期，宿主先天免疫細胞（如樹突狀細胞和單核細胞）通過模式識別受體（PRRs），主要是RIG-I樣受體（RLRs）和Toll樣受體（TLRs），快速激活I型干擾素（IFN-I）信號通路。IFN-I進一步誘導數百個干擾素刺激基因（ISGs）的表達，這些基因干擾病毒進入、基因組復制、蛋白質翻譯和子代病毒粒子釋放等關鍵過程，在控制病毒血癥和阻斷全身性病毒傳播中發揮著不可替代的核心作用。目前研究已鑒定出多個具有明確抗ZIKV活性的ISGs，典型例子包括2′,5′-寡腺苷酸合成酶1b（OAS1B）、干擾素刺激外切核酸酶基因20（ISG20）、干擾素誘導跨膜蛋白3（IFITM3）、PML基因和干擾素α誘導蛋白6（IFI6）。

值得注意的是，盡管ISGs在限制ZIKV感染中起關鍵作用，但ZIKV也進化出多種免疫逃避機制來拮抗IFN-I信號通路。例如，ZIKV非結構蛋白NS5通過直接結合并介導信號轉導和轉錄激活因子2（STAT2）的降解來抑制IFN-I反應。非結構蛋白3（NS3）通過模擬14-3-3蛋白的結合基序干擾RLR（RIG-I/MDA5）介導的干擾素（IFN）信號傳導。這些機制提示，ZIKV可能利用不同宿主組織特異性免疫微環境的差異，驅動ISG抗病毒網絡進行動態適應性調控，從而實現組織定植和持續性感染。

ZIKV具有廣泛的宿主細胞嗜性。其核心致病特征之一是直接感染神經祖細胞（NPCs），通過誘導細胞周期停滯和凋亡，最終導致先天性小頭畸形等嚴重神經系統癥狀。同時，病毒在神經組織中的持續存在引發慢性炎癥反應，進一步加劇神經損傷。先前研究證實，外源性IFN-I補充可在一定程度上減輕ZIKV誘導的神經毒性；然而，ISG網絡在免疫系統和神經系統之間的功能保守性或差異性程度仍不清楚。

基于上述研究背景，本研究整合批量轉錄組學和單細胞轉錄組學，系統探索了ZIKV感染過程中ISGs的時空調控，重點分析了其在免疫應答和神經保護中的雙重功能。結果不僅揭示了此前未被認識的ISG效應物的功能可塑性，也為后續開發針對特定ISGs的ZIKV感染治療策略提供了關鍵實驗證據和理論支持。

材料與方法

本研究使用的所有公共轉錄組數據集均檢索自美國國家生物技術信息中心（NCBI）的基因表達綜合庫（GEO）數據庫。GSE123816數據集包含了經IFN處理的ZIKV感染人腦類器官的轉錄組數據，用于探索IFN調控下腦類器官基因表達的動態變化。GSE230571數據集包含了經IFN處理的ZIKV感染人單核細胞來源樹突狀細胞（moDCs）的單細胞轉錄組數據，用于在單細胞水平研究IFN對ZIKV感染細胞轉錄組的影響。GSE129882數據集包含了ZIKV急性感染患者外周血樣本的轉錄組數據，用于分析急性感染期宿主基因轉錄變化。

基于GSE129882和GSE123816數據集的批量轉錄組數據，使用R包edgeR篩選差異表達基因（DEGs），顯著性閾值設定為調整后p值小于0.05。使用R包ggplot2生成火山圖和箱線圖等可視化圖表，同時使用pheatmap包繪制DEGs表達熱圖以說明基因表達差異特征。對篩選出的DEGs，使用R包clusterProfiler進行基因本體（GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，篩選標準為p值小于0.05，旨在揭示DEGs涉及的核心生物學功能和信號通路。

使用維恩圖和在線工具EVenn對GSE129882和GSE123816數據集的DEGs進行交叉分析，識別兩個數據集共享的DEGs。將這些共享DEGs輸入STRING數據庫，使用默認參數構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡。使用Cytoscape 3.9軟件可視化PPI網絡，并使用內置的最大團中心性（MCC）算法計算節點連接度評分，將連接度評分最高的基因定義為樞紐基因。

基于GSE230571數據集的moDCs單細胞轉錄組數據，使用R包Seurat進行標準化分析。過濾掉RNA計數大于60,000或小于500、且獨特基因計數小于1,000的低質量細胞。使用"LogNormalize"方法對剩余細胞的基因表達矩陣進行標準化。使用"vst"方法篩選每個樣本2,000個高變基因（HVGs）。使用FindClusters函數將細胞劃分為20個簇，使用AddModuleScore函數計算每個簇的ISGs活性評分。使用Seurat內置的FindMarkers函數篩選不同細胞簇之間的DEGs，以揭示IFN調控下moDCs的細胞亞群特異性轉錄特征。

將本研究中篩選出的22個最顯著的DEGs輸入連通性圖譜（CMap）數據庫，通過基因表達特征匹配預測對ZIKV感染具有潛在治療作用的小分子藥物。

使用人非小細胞肺癌細胞系A549。當A549細胞生長至對數生長期（融合度70%–80%）時，以感染復數（MOI）為1感染ZIKV（PRVABC59株），感染后繼續培養24小時。在ZIKV感染24小時后，收集A549細胞并使用RNeasy Mini Kit提取總RNA。使用PrimeScript? RT試劑盒合成互補DNA（cDNA）。以合成的cDNA為模板，在實時熒光定量PCR儀上使用SYBR Green熒光染料進行檢測。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參基因，使用2^?ΔΔCt方法計算目標ISGs表達水平的相對倍數變化。

使用Lipofectamine 3000試劑將小干擾RNA（siRNA）瞬時轉染至A549細胞。通過測量ATP水平評估細胞毒性。

所有實驗數據均獨立重復至少三次，計量數據以均值±標準差表示。使用GraphPad Prism 9軟件進行統計分析：兩組間比較采用Student t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。p值小于0.05被認為具有統計學意義。

結果

轉錄組學鑒定IFN-β誘導的ISGs保護人腦類器官免受ZIKV誘導的神經損傷

先前研究證實，干擾素β（IFN-β）可通過調控下游ISGs的轉錄表達來緩解ZIKV感染引起的人腦類器官發育缺陷；然而，介導這種神經保護功能的具體關鍵效應ISGs仍不清楚。為識別IFN-β在抗ZIKV神經保護中的關鍵效應ISGs，本研究利用ZIKV感染人腦類器官模型的RNA測序數據（GSE123816數據集），系統比較了IFN-β處理組與未處理組之間ISGs的表達特征。

通過差異表達分析，我們在IFN-β處理的ZIKV感染類器官中鑒定出91個DEGs，其中83個基因上調，8個基因下調。值得注意的是，上調的DEGs中富集了具有已知抗病毒功能的ISG家族成員，如IRF7、IRF9、IFI6和IFITM3，提示這些基因可能在抑制ZIKV復制和發揮神經保護作用中起核心作用。

對91個DEGs進行的GO和KEGG分析表明，它們主要參與抗原加工和提呈、RIG-I樣受體信號通路和Toll樣受體信號通路等生物學過程。這些結果進一步凸顯了IFN-β在調控ZIKV感染應答中的關鍵作用。

單細胞轉錄組學揭示moDCs中IFN-β驅動的抗病毒ISGs異質性

人moDCs是ZIKV的主要靶細胞之一。由于其能夠模擬體內宿主對ZIKV感染的免疫反應，已被廣泛用作研究ZIKV-宿主相互作用的體外細胞模型。為系統分析IFN-β驅動的ISG應答在moDCs中的細胞異質性，本研究利用單細胞轉錄組測序分析了ZIKV感染的人moDC樣本（數據集GSE230571）。實驗設計包括IFN-β預處理組和未處理對照組，以闡明IFN-β對moDCs中ISGs表達異質性的調控作用。

經過嚴格的樣本質量控制后，進行均勻流形近似與投影（UMAP）降維分析，將所有合格細胞劃分為20個不同的簇并進行可視化。使用Seurat包中的AddModuleScore函數計算每個細胞簇的ISG活性評分。結果顯示，與未處理對照組相比，IFN-β預處理組中moDCs的所有細胞簇均表現出更高的ISG活性。這表明IFN-β預處理可以系統性地激活moDCs中的抗病毒應答程序，且這種激活效應在細胞群體中具有廣泛覆蓋性。

為進一步闡明ISGs在ZIKV感染moDCs中的功能差異及其與細胞異質性的關聯，根據ISG活性評分將20個細胞簇分為兩個功能簇：ISG高活性簇（ISG_high）和ISG低活性簇（ISG_low）。使用Seurat包中的FindMarkers函數分析兩個簇之間的DEGs，從而識別出241個上調基因和44個下調基因。結果顯示，兩個簇之間表達差異最顯著的ISG是IFI27（干擾素α誘導蛋白27）。該結果與先前認為IFI27在IFN介導的抗登革病毒應答中起關鍵作用的結論一致。

對ISG_high與ISG_low簇之間上調基因的GO功能富集分析表明，這些DEGs主要富集于"對病毒的應答"、"對病毒的防御應答"和"病毒過程的負調控"等生物學過程。這進一步證實了ISG活性差異是moDCs響應ZIKV感染的核心功能異質性特征，且IFN-β可通過調控不同細胞簇中的ISG活性來塑造moDC抗病毒免疫應答的異質性。

ZIKV感染患者PBMCs轉錄組揭示ISGs的動態調控

為系統分析自然ZIKV感染過程中ISGs的動態調控，本研究基于GSE129882數據集，利用轉錄組學比較了ZIKV感染患者急性期和恢復期外周血單核細胞（PBMCs）。

使用R包edgeR篩選DEGs，閾值設定為FDR小于0.05且絕對log₂FC大于1.5。在急性期與恢復期相比共鑒定出210個顯著DEGs：195個上調，15個下調。核心上調的DEGs包括IRF7和IFITM1等典型ISGs，提示機體在急性期通過上調ISGs建立抗病毒防御。

使用R包clusterProfiler對210個DEGs進行GO注釋和KEGG富集分析。GO注釋中，生物學過程（BP）富集于"對病毒的應答"等免疫相關過程；細胞組分（CC）富集于"染色體區域"等術語；分子功能（MF）富集于"染色質結構組成成分"等術語。KEGG分析顯示，富集了"甲型流感感染"等通路，表明宿主對ISGs的調控在不同病原體間相對保守。

鑒定ZIKV感染中神經系統和免疫系統的共同ISGs

為識別在ZIKV感染過程中同時調控神經系統和免疫系統（ZIKV體內靶向的兩個關鍵區室）的ISGs，我們整合了兩個分別代表這些生理系統的轉錄組數據集。第一個數據集來自ZIKV感染的人腦類器官（神經系統的有效體外模型），第二個數據集來自ZIKV暴露的PBMCs和moDCs——這些細胞類型對于介導免疫系統中的抗病毒免疫至關重要。使用R包VennDiagram進行交叉分析，揭示了兩個系統的DEGs中存在22個共同基因。有趣的是，所有這些DEGs都是ISGs。功能富集分析證實，這些共同ISGs顯著富集于病毒感染應答和免疫調控相關通路，提示它們可能是介導跨系統抗病毒應答的關鍵分子。此外，使用STRING數據庫構建了22個共同ISGs的PPI網絡，闡明了分子相互作用模式。同時，使用CMap數據庫預測可能調控這些基因的潛在化合物。

為評估這22個ISGs作為ZIKV感染診斷生物標志物的潛力，采用最小絕對收縮和選擇算子（LASSO）邏輯回歸模型進行篩選，最終鑒定出11個基因（即IRF7、IFIT3、IFI35、IFI44、IFIH1、IFI27、IFITM1、TNFSF10、RSAD2、OAS3和EPSTI1）作為ZIKV感染的潛在診斷生物標志物。

這些基因在急性期相較于恢復期顯著上調。為進一闡明這11個基因在ZIKV感染期間的表達特征，以人非小細胞肺癌A549細胞為模型，檢測其在ZIKV感染后24小時的表達水平。使用定量實時PCR（qRT-PCR）比較感染組與模擬感染對照組中11個基因的相對表達水平。結果顯示，所有基因在感染組均顯著上調，其中IFI44和IFI27上調最為顯著，表明這些基因可能參與調控宿主在神經系統和免疫系統中對ZIKV感染的應答。

在11個候選生物標志物中，選取了7個先前未報道與ZIKV感染相關的基因（即IFI44、IFI35、IFI27、IFIT3、OAS3、TNFSF10和EPSTI1）通過siRNA介導的基因敲低進行功能驗證。將靶向這些基因的siRNAs轉染至A549細胞。隨后，感染轉染細胞并測定病毒RNA拷貝數。敲低IFI35、IFI44或OAS3導致ZIKV RNA拷貝數相較于非靶向對照顯著增加。這證實了這些基因通過抑制ZIKV復制發揮抗病毒作用。為排除增強的病毒復制是由siRNA誘導的細胞毒性所致，使用CellTiter-Glo法評估細胞活力。與陰性對照（siNC）組相比，任何siRNA處理組均未觀察到活力的顯著降低。

討論

2016年，世界衛生組織（WHO）將ZIKV感染列為國際關注的突發公共衛生事件。ZIKV通過性接觸、垂直傳播和伊蚊叮咬傳播。感染可導致嚴重神經系統疾病，如感染者中的GBS和腦膜腦炎，以及受感染母親所生嬰兒的先天性小頭畸形。迄今為止，仍無獲批的ZIKV治療藥物或預防疫苗。IFN-I系統是宿主對抗病毒感染的核心防御機制：研究證實，Ifnar1^?/?小鼠對致死性ZIKV感染的易感性顯著增加，而外源性IFN-β補充不僅能抑制ZIKV在人陰道/宮頸上皮細胞中的復制，還能減輕ZIKV在腦類器官中誘導的神經毒性。然而，在IFN-I誘導的數百個ISGs中，哪些在ZIKV發病機制中起關鍵作用仍不清楚。

ZIKV可直接入侵宿主神經系統并造成神經損傷，先前研究報道IFN-β可減輕ZIKV誘導的神經損傷。為識別介導這種神經保護作用的關鍵干擾素效應基因，本研究分析了經IFN-β處理和未處理的ZIKV感染腦類器官的基因表達譜，鑒定出91個DEGs。值得注意的是，IFN-β處理的腦類器官與自然感染患者PBMCs之間的DEGs有33%重疊，表明ISG功能在免疫系統和神經系統之間既表現出保守性又具有組織特異性。這些共享的ISGs包括先前報道具有ZIKV神經保護作用的成員。例如，Richard等人證實RSAD2（viperin）通過抑制中樞神經系統中的ZIKV復制發揮保護作用。后續的GO和KEGG分析表明，IFN-β處理腦類器官中富集的通路大多與病毒防御應答相關，與自然ZIKV感染期間激活的干擾素信號通路一致。然而，自然感染誘導的ISGs與IFN-β處理誘導的ISGs并未完全重疊——這一發現與先前研究一致，因為ZIKV可通過其編碼的病毒蛋白拮抗宿主的干擾素信號通路以促進自身復制。

為在單細胞水平進一步分析IFN-β驅動的干擾素效應基因的表達特征，本研究檢測了ZIKV感染人moDCs（公認的ZIKV靶細胞）的單細胞轉錄組。正如預期，經IFN-β預處理的ZIKV感染moDCs顯示出比未處理組更高的ISG活性。根據ISG活性評分將細胞簇分為ISG_high和ISG_low組，并使用FindMarkers函數進行差異基因分析。結果顯示，moDCs中IFN-β誘導的ISGs不同于自然感染PBMCs和ZIKV感染腦類器官中的ISGs，表明不同組織來源和細胞類型的ISG應答存在顯著異質性。

PBMCs是研究宿主對自然ZIKV感染應答的理想模型。本研究進一步分析了ZIKV感染患者急性期和恢復期PBMCs中的DEGs，鑒定出210個顯著DEGs。GO和KEGG分析表明，這些DEGs主要富集于免疫相關通路和病毒感染相關通路（例如，與甲型流感、丙型肝炎和2019冠狀病毒病（COVID-19）相關的通路），提示ZIKV感染可能激活與其他病毒感染共同的信號通路。此外，觀察到與系統性紅斑狼瘡（SLE）相關通路的富集。宿主對ZIKV建立起強大但自限性的防御。這體現在急性期ISGs（如IRF7和STAT2）的短暫上調，類似于SLE中的干擾素特征，但與SLE不同，這種特征在恢復期逐漸消退。該模式與"ZIKV感染誘導免疫過度活化隨后病毒清除"的臨床觀察一致。

通過整合多系統轉錄組數據，本研究系統描繪了ZIKV感染期間ISGs在免疫和神經系統中的動態應答特征。為篩選跨系統調控ZIKV感染的關鍵ISGs，使用維恩圖識別三個獨立數據集（腦類器官、moDCs和PBMCs）中重疊的DEGs，最終獲得22個候選基因。這些候選ISGs在ZIKV感染的多個系統中具有代表性，且具有密切的分子相互作用，形成了一個核心抗ZIKV ISG網絡。其中部分基因的抗ZIKV功能已被證實：IRF7作為IFN-I信號通路的核心轉錄因子，在上調時可通過正反饋進一步放大宿主的抗病毒應答；IFITM1和IFITM3通過抑制病毒包膜與宿主細胞膜的融合來限制ZIKV進入細胞及后續復制；IFIH1（MDA5）作為RNA病毒的模式識別受體，可特異性識別ZIKV RNA并啟動IFN-I產生。為評估這些候選基因的藥物開發潛力，使用CMap數據庫預測靶向這些基因的潛在化合物。

為驗證22個候選ISGs作為ZIKV感染生物標志物的潛力，使用LASSO邏輯回歸模型篩選出11個潛在診斷標志基因。結果顯示，與恢復期相比，所有11個基因在急性期均顯著上調。通過A549細胞系感染實驗的進一步驗證證實，所有11個基因在ZIKV感染后均上調，其中IFI27和IFI44上調最為顯著（值得注意的是，IFI27已被報道為登革熱感染中的關鍵ISG）。在11個候選基因中，選取了7個先前未報道與ZIKV感染相關的基因（即IFI44、IFI35、IFI27、IFIT3、OAS3、TNFSF10和EPSTI1）通過siRNA介導的基因敲低進行功能驗證。結果顯示，敲低IFI35、IFI44或OAS3后，細胞中的ZIKV RNA拷貝數顯著增加，表明這三個ISGs是抑制ZIKV復制的內源性宿主限制因子。在確立其功能作用后，我們進一步評估了IFI35、IFI44和OAS3的診斷潛力。受試者工作特征（ROC）曲線分析表明，所有三個基因均能有效區分急性期和恢復期，IFI44的曲線下面積（AUC）為0.885，OAS3為0.836，IFI35為0.747。

因此，本工作在兩個方面對現有報道進行了補充：首先，提供了直接的功能缺失證據，確立IFI35、IFI44和OAS3為相關人類細胞模型中真正的ZIKV限制因子，從而為先前在小鼠同源物Ifi44l中提示的作用提供了關鍵的人類細胞驗證；其次，通過ROC分析定量定義了它們作為生物標志物的高診斷效用，其中IFI44成為特別強的候選者（AUC = 0.885）。

該結果證實本研究所建立的分析策略能夠有效地在標準化細胞模型中識別具有抗ZIKV潛力的ISGs。雖然A549細胞系為ISG功能的初步系統篩選提供了穩健且可控的系統，但我們承認該模型并不能完全代表ZIKV體內的主要細胞嗜性。因此，我們的研究結果將這些ISGs，特別是IFI35、IFI44和OAS3，定位為未來在更具生理相關性的模型（如神經類器官或原代免疫細胞）中進行研究的高優先級候選物，以進一步鞏固其抗病毒相關性并探索組織特異性機制。

結論

2020年COVID-19大流行進一步引起科學界對新興病毒造成的全球公共衛生威脅的關注。WHO已將多國猴痘疫情列為"國際關注的突發公共衛生事件"，高致病性禽流感A（H5N1）病毒的持續傳播也對人類和動物健康構成重大威脅。黃病毒屬的單鏈RNA病毒可引起嚴重人類疾病，其流行與昆蟲媒介、城市化、氣候變化和全球旅行有關。其中，ZIKV因其與先天性小頭畸形和胎兒死亡的關聯而成為該家族中備受關注的關鍵致病病毒。目前，尚無獲批用于預防和治療ZIKV的藥物或疫苗：抗病毒策略主要靶向病毒本身或宿主因子，后者可避免病毒突變導致的治療失敗。IFN信號通路及相關基因構成了宿主對抗ZIKV的第一道防線，為