《Plant Biotechnology Journal》：Serial Spatial Transcriptomes Reveal Regulatory Transitions in Maize Leaf Development
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本綜述系統總結了利用10× Genomics Visium系統優化的空間轉錄組技術，在玉米幼苗莖尖分生組織（SAM）及連續發育葉片中重建三維基因表達譜的研究。文章通過空間-時間轉錄組分析，識別了參與分生組織維持、葉原基起始、維管組織分化和細胞異質性的關鍵調控基因，并開發了從切片制備到數據處理的完整實驗流程。該研究為解析植物發育轉換、細胞類型特化和分化的分子事件提供了重要技術平臺和理論基礎。
優化玉米幼苗莖尖切片構建空間轉錄組的技術流程
研究團隊針對植物組織特點對10× Genomics Visium空間基因表達系統進行了技術優化。通過比較"先新鮮冷凍"和"先OCT浸泡"兩種冷凍保存方法，發現兩種方法均能良好保持RNA完整性（RIN值分別為9.2和9.4）。實驗證明甲基丁烷、甲醇、異丙醇、室溫孵育、染色染料、蛋白酶K或胃蛋白酶介導的透化處理等關鍵步驟對RNA質量無顯著影響，但胃蛋白酶在0.1N HCl中的孵育時間對RNA完整性具有時間依賴性影響。
特別值得關注的是，研究團隊開發了"兩步OCT包埋"技術，通過先將組織樣品浸泡在稀釋的OCT中防止氣泡形成，精確定向后用最小量OCT進行冷凍固定，有效減少了細胞內冰晶形成。這種改良方法特別適用于復雜脆弱的SAM結構，確保了切片組織的完整性和mRNA捕獲效率。
獲取發育中玉米葉片的連續空間轉錄組
在實驗設計上，研究團隊選擇了玉米莖尖的橫切面作為研究對象，因為植物結構如SAM和葉原基在橫切面視圖中更容易區分。通過對72小時吸脹后的玉米幼苗進行解剖，每個生物學重復獲得3-4個從SAM頂端到其下方約108μm的連續橫切面，共獲得14個生物學重復的54個切片數據。
技術流程包括冷凍切片、VT Slide顯微成像、測序文庫構建和Illumina短讀長測序。每個6.5×6.5mm捕獲區域可容納單個幼苗的3-4個莖尖橫切面，組織覆蓋斑點比例從18.86%到40.52%不等。測序數據顯示，每個斑點的平均讀數范圍從79828到155375，每個斑點檢測到的基因中位數從4623到8416，數據質量與哺乳動物組織數據集相當。
空間轉錄組方法的高可靠性驗證
通過整合14個數據集并進行歸一化處理，研究發現組織斑點根據結構域緊密聚集，可分為三個明顯組別：SAM和發育葉片、胚芽鞘以及胚芽鞘內維管組織。已知標記基因的表達模式驗證了該方法的可靠性，如Knotted-1（KN1）和NAC轉錄因子119（NAC119）主要在SAM斑點中表達，而Auxin Import Carrier 4（AIC4）和DNA-binding with one finger transcription factor 11（DOF11）在胚芽鞘維管中顯示主要或相對高表達。
與90個通過探針原位測序（ISS）檢測的基因比較顯示，69個基因在兩種方法中呈現高度匹配的表達模式。此外，研究人員通過墊鎖探針原位雜交驗證了AIL6、ANT1、ANT3和TML1等基因的表達模式，結果與空間轉錄組譜基本一致。
玉米發育莖尖的基因表達譜特征
偽批量基因表達譜的主成分分析（PCA）顯示四個主要組別：SAM、發育葉片、胚芽鞘和胚芽鞘維管。層次聚類分析表明，胚芽鞘階段的基因表達譜最為獨特，與其他發育階段差異顯著。通過基因表達趨勢的層次聚類，研究人員識別了7個主要基因簇，反映了從未分化的SAM到各分化階段葉片的發育軌跡。
基因本體（GO）富集分析揭示了三個主要生物學主題：簇1富含核心生物合成、基因表達和細胞組織相關術語，反映了分生組織域的快速細胞循環；簇6以共價染色質和組蛋白修飾為特征，表明細胞退出分生組織并承諾分化時的表觀遺傳重塑；簇7顯示防御、次級代謝和創傷反應特征，表明這些幼年保護組織中存在預期防御程序。
發育中玉米莖尖細胞類型的鑒定與表征
通過無監督聚類，研究團隊在玉米莖尖中識別出33個不同的簇，基于空間定位和獨特基因表達模式將其分類為12個主要超群。與發育葉片相關的簇被分類為"SAM_P4"、"leaf_meso"和"leaf_vein"，分別代表從莖尖分生組織到P3-P4發育階段的細胞、P4和P5中的非維管葉肉和表皮細胞以及相同發育階段內的維管組織。
值得注意的是，胚芽鞘表現出顯著的轉錄異質性，特別是在基本組織中。雖然該區域組織學上由形態統一的薄壁細胞組成，但轉錄組分析揭示了不同的分子域。研究團隊鑒定了"co_meso_polar"、"co_meso_ad"、"co_meso_nearvein"等分子域，以及代表向軸和背軸維管域的"co_vein_ad"和"co_vein_ab"。
連續發育葉片中的基因表達順序
研究發現，在"SAM和發育葉片"組中，結構域的組織順序為SAM、P1_P2、P3、P4和P5，忠實地反映了組織分化的順序和復雜程度。通過RNA速度和偽時間分析，研究人員證實了觀察到的基因表達轉換反映了玉米葉片的形態發育。盡管只有7%的總UMI讀數是新生轉錄本，但RNA速度估計仍顯著預測了從SAM到P5的核心發育軌跡。
早期葉片發育的時間順序基因共表達網絡
通過時間順序基因共表達網絡（TO-GCN）分析，研究團隊在空間轉錄組中識別了1265個轉錄因子（TF）基因，根據基因共表達（皮爾遜相關系數PCC>0.95）將其組織成13個層次水平。基因富集分析顯示特定模式：SAM在L1到L4水平有TF富集峰值；早期葉原基（P1-P2）在L5和L6；中期葉片發育（P3）在L7；更高級葉片發育（P4）在L9；相對成熟葉片階段（P5）在L9和L10。
單細胞參考與空間圖譜的整合
研究人員將已發表的玉米單細胞RNA測序數據集與空間轉錄組進行比較，發現26925個基因的偽批量表達譜具有強一致性（Spearman's ρ=0.80）。通過Harmony校正有效去除了批次特異性效應，單細胞RNA測序UMAP解析為對應于精細細胞身份的緊湊、批次混合的島嶼。相比之下，Visium UMAP將這種組織和細胞類型異質性表示為一個連續的雙葉流形，通過一個橋梁連接，對應于從SAM→P1/P2→P3→P4→P5的發育軸。
候選TF調控因子指定莖尖分生組織和葉原基起始
為鑒定參與SAM發育或葉原基分化的候選TF，研究人員比較了五個結構域之間的差異基因表達分析結果和TO-GCN的L1和L2水平中鑒定的TF，發現了30個共同基因。這些基因包括Delayed Flowering 1（DLF1）轉錄因子，其在空間轉錄組數據中的表達水平從SAM到P3非常高，但在P4顯著降低。
通過三維重建技術，研究人員展示了基因表達沿莖尖遠端-近端軸的連貫模式。例如，NAC119和HB46在單個幼苗（VR03）的四個連續切片和合并這些切片的三維重建中顯示一致模式，證明了如何沿遠端-近端軸檢查表達。
SAM或葉片發育中候選基因的功能特征
研究團隊重點關注了15個在玉米莖尖分生組織和早期葉原基中表達的玉米GRF轉錄因子。基于系統發育樹中的兩個主要分支，這些ZmGRFs的表達模式被組織起來。為進行功能驗證，優先選擇ZmGRF6作為SAM富集的DEG；ZmGRF8通過層次聚類位于最早表達程序中；ZmGRF10在P4-P5顯示遠端峰值，將覆蓋范圍擴展到后期早期葉片發育。
通過CRISPR/Cas9介導的誘變，研究人員在Setaria viridis中創建了這三個基因的orthologs突變體。這些突變導致移碼，引入提前終止密碼子，產生缺乏保守QLQ和WRC結構域的截短GRF蛋白。所有三個編輯品系均顯示SAM高寬比顯著降低，其中CRP-SvGRF6的影響最強。較小的SAM穹頂與降低的株高相關，表明枝條生長受限。
與ZmGRF10的遠端（P4-P5偏向）表達模式一致，CRP-SvGRF10植株表現出葉長顯著減少，而葉寬不變；相比之下，CRP-SvGRF6和CRP-SvGRF8在這兩個性狀上與野生型無顯著差異。這些數據表明這三個GRFs是分生組織生長的強陽性調節因子，并將GRF10與早期葉外生長聯系起來，為從空間轉錄組分析推斷的階段和域特異性作用提供了實驗支持。
