胰腺導管腺癌（PDAC）是全球最具致死性的惡性腫瘤之一，其發病率排名第12位，但癌癥相關死亡率高居第6位。目前手術切除仍是唯一可能治愈的治療方法，然而僅約20%的患者在診斷時符合手術條件。盡管免疫檢查點抑制劑等免疫療法在某些惡性腫瘤中取得了突破性成功，但其在PDAC中的療效顯著受限。這主要歸因于PDAC高度免疫抑制的腫瘤微環境（TME），其特征包括廣泛的基質纖維化和免疫抑制細胞浸潤，如癌癥相關成纖維細胞（CAFs）、腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）和耗竭的細胞毒性T淋巴細胞。這一免疫屏障不僅促進腫瘤生長和轉移，還嚴重阻礙了免疫療法的臨床成功。

RNA修飾已成為基因表達和腫瘤免疫的關鍵調節因子。其中，假尿苷（Ψ）是RNA中最豐富的修飾之一，由假尿苷合成酶（PUS）催化尿苷異構化為假尿苷。人類基因組編碼13種假尿苷合成酶，分為五個進化上保守的家族：TruA、TruB、TruD、RluA和Pus10p。這些酶廣泛參與RNA剪接、穩定性和翻譯調控，其失調與多種人類疾病相關。PUS酶對RNA剪接、穩定性和翻譯的調控主要通過催化假尿苷（Ψ）形成來實現。PUS家族在癌癥和其他人類疾病中的參與日益受到關注。其中，PUS7作為TruD家族的唯一成員，已被證實與膠質母細胞瘤、結直腸癌和胃癌的腫瘤進展相關，根據癌癥類型的不同報道了其致癌和抑癌作用。此外，其他PUS家族成員，如PUS1、PUS3、RPUSD3、RPUSD4和PUS10，與線粒體功能障礙、神經發育障礙和自身免疫性疾病相關。這五個家族的PUS酶根據其保守的催化結構域和底物特異性在功能上有所區別。本研究的焦點PUS7，在底物選擇上可能與其他家族的成員不同。這些發現表明PUS酶可能參與多種生物過程，并以環境依賴性方式促進疾病發展。

中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）是由DNA、組蛋白、蛋白酶和抗菌蛋白組成的網狀結構，由中性粒細胞通過一系列涉及活性氧、中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）、髓過氧化物酶（MPO）活性和瓜氨酸化組蛋白H3（CitH3）的過程釋放。NETs最初被描述為抗菌防御結構，后來成為腫瘤進展的重要貢獻者。研究表明，NETs可以促進上皮-間質轉化，增強卵巢癌中的腫瘤生長，并在小鼠模型中加速PDAC進展。除了對腫瘤細胞的直接影響外，NETs還塑造腫瘤免疫微環境。例如，它們可以激活胰腺星狀細胞以支持腫瘤增殖，并已被證明在黑色素瘤和胃癌中誘導TAMs的M2極化，從而促進免疫逃避和轉移。

本研究進行了PUS家族的全面泛癌分析，整合了轉錄組、基因組、表觀遺傳和臨床數據集，系統評估了它們在不同癌癥類型中的表達模式、預后相關性、通路關聯以及與TME的關系。值得注意的是，盡管PUS家族基因在多種惡性腫瘤中表現出異質性表達和臨床關聯，但PDAC成為一個腫瘤類型，其中PUS相關特征顯示出與TME的免疫抑制相關特征特別強的聯系。鑒于PDAC的定義特征——包括其致密的基質、深刻的免疫排斥和對免疫檢查點阻斷的抵抗——這種癌癥類型代表了一個生物學相關的背景，其中失調的RNA修飾可能發揮顯著的免疫調節作用。

同時，積累的證據表明NETs是PDAC中免疫逃避和疾病進展的關鍵介質。這些觀察使我們假設特定PUS酶的異常活性可能通過調節NET形成和下游免疫細胞極化來促進PDAC的發病機制。因此，選擇PDAC作為重點模型來研究PUS7在協調腫瘤微環境內RNA修飾依賴性免疫重塑中的潛在作用。

研究團隊首先全面分析了11個PUS家族成員在33種TCGA癌癥類型中的表達模式。RPUSD1在泛癌組織中表現出顯著升高的表達，其次是TRUB2、TRUB1和PUS3。相比之下，PUS7L和PUS10表達水平較低。比較了18種癌癥類型中腫瘤組織與癌旁正常組織中PUS的表達水平。大多數PUS家族成員在泛癌樣本的癌旁正常組織中表現出顯著升高的表達。此外，還研究了PUS家族成員之間的相關性。共有36個基因對表現出顯著的正相關，12個基因對表現出顯著的負相關。值得注意的是，PUS7與所有其他家族成員均顯示出顯著的正相關。

分析了33種癌癥類型的總生存期（OS）、疾病特異性生存期（DSS）和無進展生存期（PFS）。值得注意的是，PUS7表達升高在多種癌癥類型中 consistently 成為顯著的不良預后因素，與較差的臨床結果 strongly 相關。CNV分析顯示，雜合性擴增和缺失是最普遍的改變，基因表達通常與CNV事件呈正相關。SNV分析顯示，PUS7L和PUS7中存在頻繁的有害突變，特別是在子宮體子宮內膜癌（UCEC）中。值得注意的是，RPUSD4表達在28種癌癥類型中與CNV呈顯著正相關，并且mRNA水平在擴增樣本中通常升高，在缺失樣本中降低。

進一步評估了來自ICGC/TCGA數據集的2683個泛癌樣本中的遺傳改變。總體而言，26.83%的樣本表現出PUS基因改變，其中CNVs（17.97%）的發生率遠高于突變（2.09%）。擴增是主要的CNV亞型（15.51%），尤其是在PUS7中。改變頻率在不同癌癥類型中介于1%至8%之間。急性髓系白血病中觀察到突變主導的譜系，而結直腸癌的突變頻率最高。擴增在幾種癌癥中占主導地位，包括肺癌和膀胱癌。Kaplan-Meier分析顯示，PUS基因改變與顯著較差的總生存期相關（HR = 1.722, p = .0139）。

系統分析了PUS家族基因在33種癌癥類型中的甲基化譜，并在14種癌癥類型中檢測到差異甲基化。與甲基化和基因表達之間已知的負相關關系一致，觀察到大多數PUS基因的甲基化與mRNA水平呈負相關，其中PUS7和RPUSD2在TGCT中顯示出最強的關聯。

研究團隊基于ssGSEA算法構建了一個評分系統，用于量化TCGA癌癥類型中的PUS家族模式，稱為PUSs。在各種癌癥類型中，ACC的PUSs最高，而PRAD的PUSs最低。與癌旁正常組織相比，PUSs在腫瘤中顯著升高，包括BLCA、BRCA、CESC、COAD、ESCA、KICH、KIRC、KIRP、LUAD、LUSC、PRAD、READ、STAD、THCA和UCEC，而在CHOL和PCPG中降低。對OS、DSS、無病生存期（DFS）和PFS進行了單變量Cox回歸分析。較高的PUSs與KIRC和PAAD的風險增加相關，但在LGG的OS中充當保護因素。雖然PUSs在HNSC、KIRC、KIRP、PAAD和THYM中是風險因素，但在LGG、LUSC和STAD的PFS中是保護因素。對于DFS，由于樣本量有限，僅在STAD中觀察到正相關，其中PUSs充當保護因素。至于DSS，PUSs在KIRC、KIPC、LUAD、PRAD和THYM中是保護性的，但在LGG和STAD中是風險因素。總體而言，PUSs在多種癌癥類型中顯示出預后預測潛力，在KIRC、LGG和PAAD中具有特別強的預測性能。

考慮到癌癥干細胞在腫瘤進展和治療抵抗中的作用，使用RNA干性評分（RNAss）和DNA干性評分（DNAss）評估了PUSs與腫瘤干性的關系。PUSs在所有癌癥中與RNAss呈正相關，在大多數癌癥類型中與DNAss呈正相關，表明其在促進干性和腫瘤去分化中的潛在作用。

MSI和TMB是預測ICI反應的既定生物標志物。分析了PUSs與這些生物標志物在不同癌癥類型中的相關性。PUSs在18種癌癥中與TMB呈正相關，在8種癌癥中與MSI呈正相關，其中在STAD中觀察到最強的關聯。為了研究PUS7家族在癌癥中的免疫浸潤，分析了PUSs與TME之間的關聯。PUSs在大多數癌癥中與基質評分、免疫評分和ESTIMATE評分呈負相關，并且與腫瘤純度呈正相關。此外，PUSs與大多數免疫檢查點基因的表達呈負相關，并且與多種算法中的免疫細胞浸潤呈負相關，表明其與免疫抑制性TME相關。

對50個 hallmark 通路進行了GSVA。PUSs與增殖和細胞周期相關通路 strongly 相關，包括E2F靶標、G2M檢查點、MYC靶標、有絲分裂紡錘體和DNA修復。此外，PUSs與代謝通路呈正相關，如脂肪酸代謝、糖酵解和氧化磷酸化，表明PUS-high腫瘤中代謝活性升高。

鑒于在KIRC、LGG和PAAD中觀察到的PUSs強烈的預后相關性，進一步研究了PUS家族基因在TCGA-PAAD隊列中的表達模式和功能意義。PUS1、RPUSD1和RPUSD3的表達水平與RNAss和DNAss呈正相關，但與基質評分和ESTIMATE評分呈負相關。結果表明，PUS家族成員，包括PUS1、RPUSD1、RPUSD3和PUS7，可能有助于增強腫瘤干性和建立PAAD中的免疫抑制微環境。此外，單變量和多變量Cox回歸分析證實，PUS7是PAAD患者的獨立不良預后因素（HR = 3.824, 95% CI: 1.475–9.916, p = .006）。

為了進一步闡明PUS家族基因表達與腫瘤行為之間的關系，驗證了PUS7在PDAC中的mRNA和蛋白水平。TCGA、CPTAC和GSE數據集的整合分析一致顯示，PUS7在PDAC組織中顯著上調。基于TCGA和GTEx數據集組合的受試者工作特征曲線下面積（AUC）為0.822（95% CI: 0.777–0.867），突出了PUS7在PDAC中的強大診斷潛力。Kaplan-Meier生存分析進一步證明，較高的PUS7表達與PDAC患者較差的總生存期顯著相關。

為了在臨床標本中驗證這些發現，分析了一個包含56名PDAC患者的隊列的腫瘤組織。IHC染色證實，與癌旁非腫瘤胰腺組織（ANT）相比，腫瘤組織中的PUS7表達顯著更高。值得注意的是，PUS7表達升高與總生存期降低相關，加強了其作為陰性預后標志物的潛力。驗證了多個PDAC細胞系中相對于正常胰腺導管上皮細胞（HPDE）的PUS7 mRNA水平和蛋白水平。來自12名PDAC患者的配對腫瘤和癌旁正常組織的Western blot分析進一步證實了腫瘤樣本中PUS7蛋白水平的顯著增加。總之，這些發現表明PUS7在PDAC中上調并與不良預后 strongly 相關，強調了其作為生物標志物和治療靶點的潛力。

研究團隊建立了穩定過表達或敲低PUS7的PANC-1和MIA PaCa-2細胞系，并通過Western blotting證實了PUS7表達的改變。功能測定，包括傷口愈合、Transwell遷移和侵襲、集落形成和EdU摻入，證明PUS7敲低顯著抑制了PDAC細胞的遷移、侵襲、克隆形成和增殖能力。相反，PUS7過表達增強了這些惡性表型。隨后在裸鼠中進行了皮下異種移植實驗。與對照組相比，PUS7缺失的細胞表現出顯著減少的體積和重量，而PUS7過表達的腫瘤顯示出明顯加速的生長。總之，這些結果表明PUS7沉默在體外和體內抑制腫瘤生長，而其過表達促進腫瘤生長。

為了進一步研究PUS7在PDAC中功能的調控機制，對PUS7過表達的PANC-1細胞進行了 bulk RNA測序。差異表達分析確定了1210個差異表達基因（DEGs），包括723個上調和487個下調基因。GO分析顯示，DEGs主要富集在與免疫系統調控、細胞增殖和細胞粘附相關的生物過程中。在分子功能方面，觀察到在趨化因子、細胞因子和受體結合活性方面的富集。KEGG通路分析表明，DEGs顯著富集于多個免疫和炎癥相關通路，包括細胞因子-細胞因子受體相互作用、中性粒細胞胞外誘捕網形成、NOD樣受體信號傳導和IL-17信號傳導。腫瘤細胞的RNA測序分析顯示，PUS7過表達顯著改變了與中性粒細胞募集和激活相關的多種細胞因子和趨化因子的表達。值得注意的是，幾種與NET誘導相關的可溶性因子，包括CXCL2、CXCL8和IL-6，在PUS7過表達的腫瘤細胞中與對照組相比顯著上調。進一步的GSEA分析顯示，PUS7過表達與各種免疫相關通路呈正相關，包括B細胞受體信號傳導、IL-17信號傳導、PD-L1和PD-1檢查點通路、TH1和TH2細胞分化、Toll樣受體信號傳導、JAK-STAT信號傳導、NF-κB信號傳導和NETs形成。

研究團隊采用假設驅動的方法來研究PUS7是否通過調節NETs形成促進PDAC進展。為此，建立了胰腺癌的流體動力學小鼠模型。與對照組相比，PUS7過表達顯著增加了腫瘤負荷。在整個實驗期間，PUS7-OE組的小鼠比對照組更早且更顯著地出現體重減輕，這與該組較高的終末腫瘤負荷一致，表明體重變化有效地反映了腫瘤進展的全身影響。此外，PUS7雙向調節NETs形成。這通過體內免疫熒光得到證實，顯示PUS7過表達腫瘤中關鍵NETs標志物（MPO和CitH3）的水平上調。在體外，PUS7過表達促進了NETs形成，而其敲低則減少了NETs，通過Sytox Green染色定量并通過Western blot分析證實。總之，這些發現表明PUS7過表達可能促進PDAC中NETs的形成，這可能反過來有助于增強腫瘤進展。

對原位胰腺腫瘤進行了scRNA-seq。總共保留了27,230個高質量細胞用于下游分析。確定了22個不同的細胞簇，使用標記基因表達譜進行細胞類型注釋。鑒定了七種主要細胞類型：導管上皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、B細胞、T細胞、內皮細胞和紅細胞。通過經典標記物確認了細胞身份：導管上皮細胞的Col3a1和Col1a1；巨噬細胞的C1qc和C1qa；中性粒細胞的S100a8和S100a9；B細胞的Cd79a和Cd79b；T細胞的Cd3e、Cd3d和Cd3g；內皮細胞的Cldn5和Cdh5；和紅細胞的Hbb-bt。

PUS7過表達導致導管上皮細胞顯著增加，同時免疫細胞群減少，包括巨噬細胞、B細胞和T細胞。CellChat分析顯示，在PUS7-OE組中，細胞類型之間的相互作用數量和強度均顯著降低，其中中性粒細胞-免疫細胞串擾的下降最為明顯。進一步分析顯示，來自實質細胞的細胞間信號傳導下調，特別是涉及NOTCH、PERIOSTIN、SPP1、CCL、CD45、CXCL和THY1的通路，這些通路介導實質細胞和免疫細胞之間的通信。導管上皮細胞的KEGG通路富集分析顯示，PUS7-OE組中免疫激活通路的富集減少，同時葡萄糖和ATP代謝等代謝通路的富集增強。

為了剖析PUS7對巨噬細胞動態的影響，對巨噬細胞群體進行了聚類，并注釋了幾個功能不同的TAM亞型，包括血管生成性TAMs（Angio-TAMs）、調節性TAMs（Reg-TAMs）、炎癥性TAMs（Inflam-TAMs）、增殖性TAMs（Prolif-TAMs）和脂質相關TAMs（LA-TAMs）。PUS7過表達導致抗腫瘤的Inflam-TAMs顯著減少，而LA-TAMs、Angio-TAMs和Reg-TAMs顯著擴增，表明PUS7影響TAM向免疫抑制表型極化。

為了驗證這些發現，將THP-1衍生的M0巨噬細胞與PUS7條件培養基共培養。流式細胞術分析表明，與對照組相比，PUS7過表達顯著增加了M2/M1巨噬細胞比率，而PUS7敲低顯著降低了M2/M1比率。胰腺組織的免疫熒光染色進一步支持了這一觀察，顯示PUS7-OE組中CD86巨噬細胞數量減少，CD206巨噬細胞增加。

總之，這些結果表明PUS7過表達通過使其分化偏向免疫抑制表型來損害巨噬細胞的抗腫瘤功能。

為了確定PUS7是否通過NETs促進PDAC進展，通過將穩定過表達PUS7的Pan02細胞（Pan02-PUS7）植入C57BL/6小鼠建立了原位腫瘤模型。用DNase I（一種降解細胞外DNA的酶）處理完全消除了PUS7過表達的促腫瘤作用，表明NETs清除減輕了PUS7驅動的腫瘤生長。體重縱向監測顯示，PUS7過表達小鼠表現出更早和更大的體重減輕，而DNase I阻止了這種情況，進一步支持了NETs的全身影響。腫瘤組織的流式細胞術和免疫熒光分析進一步顯示，DNase I給藥顯著減少了PUS7過表達腫瘤中的M2巨噬細胞，同時增加了M1巨噬細胞。此外，來自DNase I處理的PUS7過表達小鼠的腫瘤表現出NETs標志物MPO和CitH3水平降低，證實DNase I在體內抑制了PUS7誘導的NETs形成。

為了直接評估PUS7對NETosis的影響，進行了體外測定。用來自Pan02-PUS7細胞的條件培養基處理中性粒細胞。與體內發現一致，該處理顯著增加了經歷NETosis的中性粒細胞的百分比，這種效應被添加DNase I所消除。該結果提供了直接證據，表明PUS7過表達以細胞外在方式增強NETosis。然而，NETs是否直接介導PUS7誘導的巨噬細胞極化仍不清楚。

為了嚴格驗證體內效應的特異性，在攜帶對照腫瘤的小鼠中進行了平行的DNase I處理。與其在PUS7過表達環境中的強效作用相反，DNase I處理在Vector對照腫瘤中沒有顯著改變腫瘤體積或巨噬細胞極化狀態，也沒有引起顯著的體重減輕。這種直接比較表明，NETs降解的抗腫瘤和免疫調節作用嚴格依賴于PUS7過表達狀態。

為了直接確定NETs是否作為連接PUS7過表達腫瘤細胞與巨噬細胞表型重編程的基本中間體，建立了一個基于Transwell的順序共培養系統。首先用來自Pan02-PUS7細胞的條件培養基刺激中性粒細胞以誘導NET形成。隨后收集產生的含有NETs的上清液并應用于巨噬細胞。為了特異性評估NETs的貢獻，在中性粒細胞刺激后添加DNase I（1.5 U/mL）以降解細胞外DNA，而不影響上游中性粒細胞活化。

引人注目的是，暴露于來自PUS7過表達腫瘤細胞的NETs-containing上清液強烈誘導了M2樣巨噬細胞極化，這通過顯著增加的CD206/CD86比率證明。重要的是，這種效應在DNase I處理后顯著逆轉，證明NETs的降解有效廢除了PUS7驅動的巨噬細胞極化。這些結果提供了直接的機制證據，表明NETs是PUS7誘導的巨噬細胞表型重編程的必要且非冗余的介質。

為了進一步驗證體內中性粒細胞和NETs的功能需求，接下來使用抗Ly6G抗體進行了中性粒細胞耗竭實驗。有效耗竭中性粒細胞顯著減弱了PUS7過表達誘導的加速腫瘤生長。一致地，腫瘤免疫微環境分析顯示，中性粒細胞耗竭顯著減少了PUS7過表達腫瘤中M2極化巨噬細胞的積累，同時部分恢復了巨噬細胞極化向較少免疫抑制表型的方向。

這些結果表明中性粒細胞是體內PUS7介導的腫瘤生長和巨噬細胞極化所必需的。

比較PUS7過表達（OE）和對照（NC）細胞的RIP-seq分析揭示了一組差異富集的mRNAs。功能富集顯示，這些PUS7結合的轉錄本參與PI3K–Akt、Ras、