在生命科學(xué)的微觀世界里，谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是一種至關(guān)重要的三肽分子，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸構(gòu)成。它在維持細(xì)胞氧化還原平衡、清除活性氧物種（Reactive Oxygen Species, ROSs）以及抵御氧化應(yīng)激等方面扮演著核心角色。正是由于其卓越的抗氧化和生理功能，谷胱甘肽在制藥、食品和化妝品工業(yè)中備受青睞，全球市場(chǎng)需求持續(xù)增長(zhǎng)。然而，如何經(jīng)濟(jì)高效地大規(guī)模生產(chǎn)這種珍貴的分子，一直是生物制造領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)的化學(xué)生產(chǎn)方法往往步驟繁瑣、成本高昂且可能產(chǎn)生環(huán)境污染。因此，利用微生物作為“細(xì)胞工廠”進(jìn)行生物合成，成為了更具吸引力的替代方案。其中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其“公認(rèn)安全”（Generally Recognized as Safe, GRAS） status 以及易于進(jìn)行遺傳操作等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用作生產(chǎn)谷胱甘肽的理想工業(yè)平臺(tái)。在酵母細(xì)胞內(nèi)，谷胱甘肽的合成遵循一個(gè)兩步酶促途徑：首先，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH1）催化谷氨酸和半胱氨酸結(jié)合形成γ-谷氨酰半胱氨酸；隨后，谷胱甘肽合成酶（GSH2）在此中間產(chǎn)物上添加甘氨酸，最終生成還原型谷胱甘肽（GSH）。然而，這個(gè)看似簡(jiǎn)單的過(guò)程卻受到精細(xì)而復(fù)雜的調(diào)控。其中，GSH1催化的反應(yīng)是整個(gè)合成途徑的限速步驟，并且會(huì)受到細(xì)胞內(nèi)積累的GSH的反饞抑制（Feedback Inhibition）。這意味著，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽濃度達(dá)到一定水平時(shí)，它會(huì)反過(guò)來(lái)抑制自身的合成，從而限制了產(chǎn)量的進(jìn)一步提升。這就像一條擁堵的生產(chǎn)線，成品堆積會(huì)減緩原料的投入速度。

另一方面，細(xì)胞為了維持內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定（穩(wěn)態(tài)），不僅會(huì)合成谷胱甘肽，也會(huì)通過(guò)降解和消耗途徑來(lái)處置“過(guò)剩”的谷胱甘肽。主要的降解途徑被稱為DUG途徑，涉及Dug1、Dug2和Dug3等蛋白的協(xié)同作用，將谷胱甘肽分解回其組成氨基酸。此外，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferases, GSTs）如Gtt1和具有GST樣活性的Ure2蛋白，會(huì)催化谷胱甘肽與各種親電物質(zhì)結(jié)合，這個(gè)過(guò)程雖然有助于解毒，但也消耗了大量的谷胱甘肽。Ure2還有一個(gè)重要功能，即作為氮分解代謝阻遏（Nitrogen Catabolite Repression, NCR）的負(fù)調(diào)控因子，影響著細(xì)胞對(duì)氮源的利用。這些消耗途徑就像工廠里的“泄洪閘”，不斷分流著寶貴的產(chǎn)物。

以往的研究多集中于強(qiáng)化合成途徑本身，例如過(guò)表達(dá)GSH1和GSH2基因。雖然取得了一定成效，但單純依靠“開(kāi)源”往往難以突破反饞抑制和降解消耗造成的瓶頸。因此，科學(xué)家們開(kāi)始思考更為集成的策略：能否在促進(jìn)合成的同時(shí)，主動(dòng)將產(chǎn)物運(yùn)出細(xì)胞以減輕反饞抑制，并關(guān)閉那些不必要的“泄洪閘”，從而將更多的資源匯集到目標(biāo)產(chǎn)物上？這正是發(fā)表在《New Biotechnology》上的這項(xiàng)研究旨在回答的核心問(wèn)題。

為了開(kāi)展這項(xiàng)研究，研究人員運(yùn)用了多項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。他們以實(shí)驗(yàn)室常用的釀酒酵母D452-2菌株及其已強(qiáng)化GSH1和GSH2表達(dá)的衍生株G1/2為出發(fā)菌株。遺傳操作方面，核心采用了CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)，用于精確敲除目標(biāo)基因；同時(shí)利用酵母整合質(zhì)粒（YIPs）過(guò)表達(dá)特定基因。發(fā)酵工藝上，關(guān)鍵采用了葡萄糖限制的高細(xì)胞密度補(bǔ)料分批發(fā)酵策略，以最大化生物量和產(chǎn)物產(chǎn)量。分析檢測(cè)則主要依賴高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，用于精確測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)、底物消耗（如葡萄糖）以及產(chǎn)物（胞內(nèi)外谷胱甘肽）的濃度。

研究人員首先探討了過(guò)表達(dá)谷胱甘肽輸出蛋白對(duì)生產(chǎn)的影響。他們將編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的GXA1基因和編碼質(zhì)子耦合反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的GEX2基因，分別導(dǎo)入到已強(qiáng)化合成的G1/2菌株中，構(gòu)建了G1/2-GXA1和G1/2-GEX2工程菌。 batch發(fā)酵結(jié)果表明，與親本G1/2菌株相比，兩個(gè)輸出蛋白過(guò)表達(dá)菌株不僅將分泌到培養(yǎng)基中的谷胱甘肽濃度提高了28%-32%，其胞內(nèi)的谷胱甘肽含量和濃度也在發(fā)酵48小時(shí)達(dá)到了峰值，分別提升了26%-32%和37%-38%。這一發(fā)現(xiàn)具有重要意義，它證實(shí)了通過(guò)促進(jìn)產(chǎn)物外排來(lái)解除反饞抑制的策略是有效的。過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能通過(guò)將谷胱甘肽從合成位點(diǎn)（細(xì)胞質(zhì)）轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外或細(xì)胞器（如液泡），降低了胞質(zhì)內(nèi)的GSH濃度，從而解除了對(duì)GSH1的反饞抑制，促進(jìn)了合成的持續(xù)進(jìn)行。此外，部分被輸出的谷胱甘肽也可能通過(guò)如OPT1等輸入蛋白被重新吸收，間接貢獻(xiàn)了胞內(nèi)積累。

在確認(rèn)輸出蛋白過(guò)表達(dá)的有效性后，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將目光投向減少谷胱甘肽的胞內(nèi)消耗。他們選擇了G1/2-GXA1菌株作為背景，利用CRISPR/Cas9技術(shù)系統(tǒng)地敲除了七個(gè)與谷胱甘肽分解代謝或消耗相關(guān)的基因：DUG1、DUG2、DUG3（DUG途徑關(guān)鍵組分）、GCG1（編碼一種胞質(zhì)γ-谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶類似蛋白）、GTT1（編碼一種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶）、URE2（編碼具有GST樣活性的氮代謝調(diào)控蛋白）以及VPS27（ESCRT-0復(fù)合體亞基，參與蛋白分選）。 batch發(fā)酵篩選結(jié)果顯示，在G1/2-GXA1基礎(chǔ)上敲除DUG2或URE2能顯著提升胞內(nèi)谷胱甘肽含量。在發(fā)酵48小時(shí)，G1/2-GXA1 ΔDUG2菌株的谷胱甘肽含量和產(chǎn)量比G1/2-GXA1菌株分別提高了26%和20%；而G1/2-GXA1 ΔURE2菌株的提升更為顯著，含量增加了46%，產(chǎn)量提高了14%。DUG2是DUG途徑中水解谷胱甘肽的關(guān)鍵酶，其敲除直接阻斷了主要的降解通路。URE2的敲除則可能通過(guò)雙重機(jī)制起作用：一方面消除了其GST樣活性導(dǎo)致的GSH消耗；另一方面，作為NCR的負(fù)調(diào)控因子，其缺失可能解除了對(duì)某些氮代謝相關(guān)基因（如編碼谷氨酸合成酶的GLT1）的抑制，增加了谷胱甘肽合成前體——谷氨酸的供應(yīng)。相比之下，敲除GTT1、GCG1等基因?qū)Ξa(chǎn)量提升不明顯，提示它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下對(duì)總谷胱甘肽周轉(zhuǎn)的貢獻(xiàn)可能有限。敲除VPS27雖提高了胞內(nèi)含量，但嚴(yán)重?fù)p害了細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致最終產(chǎn)量并未增加，因此不具有應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

為了在接近工業(yè)生產(chǎn)的條件下評(píng)估最優(yōu)菌株，研究人員對(duì)在 batch 發(fā)酵中表現(xiàn)最好的G1/2-GXA1 ΔDUG2和G1/2-GXA1 ΔURE2菌株進(jìn)行了葡萄糖限制的高密度補(bǔ)料分批發(fā)酵。在這種模式下，通過(guò)精確控制葡萄糖 feed 速率，避免乙醇過(guò)量生成，從而最大化細(xì)胞密度和產(chǎn)物合成。結(jié)果表明，雖然兩菌株的胞內(nèi)谷胱甘肽含量相近，但G1/2-GXA1 ΔDUG2菌株表現(xiàn)出更優(yōu)異的生長(zhǎng)性能，其最大干細(xì)胞重量（DCW）達(dá)到97 g/L，比G1/2-GXA1 ΔURE2菌株高14%。這最終使得G1/2-GXA1 ΔDUG2菌株在發(fā)酵80小時(shí)后，谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到2.8 g/L，比G1/2-GXA1 ΔURE2菌株高出11%。G1/2-GXA1 ΔURE2菌株生長(zhǎng)受損的原因可能與其Ure2蛋白在氮代謝調(diào)控和氧化應(yīng)激應(yīng)答中的多重功能缺失有關(guān)，這在營(yíng)養(yǎng)限制和氧化壓力較高的高密度培養(yǎng)環(huán)境中尤為不利。

綜上所述，本研究通過(guò)整合“開(kāi)源”（過(guò)表達(dá)輸出蛋白以解除反饞抑制）和“節(jié)流”（敲除降解關(guān)鍵基因以減少消耗）的雙重代謝工程策略，成功地在釀酒酵母中大幅提升了谷胱甘肽的產(chǎn)量。最終篩選出的工程菌株G1/2-GXA1 ΔDUG2，在未添加純前體氨基酸的條件下，實(shí)現(xiàn)了2.8 g/L的谷胱甘肽產(chǎn)量，這是迄今為止在釀酒酵母中報(bào)道的最高水平。這項(xiàng)工作不僅展示了一種高效生產(chǎn)谷胱甘肽的創(chuàng)新方法，凸顯了協(xié)同調(diào)控合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解網(wǎng)絡(luò)在代謝工程中的強(qiáng)大潛力，而且為利用GRAS微生物進(jìn)行其他高價(jià)值化合物的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要借鑒。其研究成果對(duì)于降低谷胱甘肽的生產(chǎn)成本，促進(jìn)其在醫(yī)藥、功能性食品和化妝品等領(lǐng)域的更廣泛應(yīng)用具有顯著的積極意義。