癌癥免疫治療領域，基于溶瘤病毒（Oncolytic Viruses, OVs）的生物療法因其能選擇性復制并裂解癌細胞而成為一種頗具前景的策略。溶瘤腺病毒（Oncolytic Adenoviruses, OVs）因其良好的安全性和有效性譜系而被廣泛應用。OVs裂解腫瘤細胞后能大量釋放腫瘤相關抗原，隨后招募樹突狀細胞（Dendritic Cells, DCs）等免疫細胞浸潤腫瘤部位，實現抗原捕獲、處理并呈遞給T細胞，從而引發腫瘤特異性T細胞免疫。然而，臨床結果顯示OVs的療效未達預期。在先前研究中觀察到，OVs在裂解腫瘤細胞的同時，也會裂解招募來的DCs，從而影響了腫瘤特異性T細胞免疫的功效。此外，瘤內注射OVs（主要的臨床給藥途徑）受到實體瘤內高壓和物理屏障的限制，影響了OVs的分布和治療效果。因此，開發能夠克服這些局限的溶瘤病毒療法對于增強癌癥免疫治療至關重要。

腫瘤細胞源性細胞外納米囊泡（Tumor cell-Derived Extracellular Nanovesicles, TDEVs）是細胞分泌的尺寸約40-150納米的納米級球形脂質雙層囊泡，具有顯著的同源細胞攝取能力。已知TDEVs表面表達的CD47具有同源靶向能力，并發出“別吃我”（Don't eat me）信號以逃避免疫細胞的識別和清除。值得注意的是，維持TDEVs的完整性和穩定性對其功能發揮至關重要。在現有研究中，TDEVs主要通過重復物理擠壓或電穿孔進行包封作為藥物載體，但這些繁瑣的方法可能會損害TDEVs的蛋白質完整性，影響其生物學功能。

為此，研究團隊開發了一種基于微針（Microneedle, MN）的原位TDEVs包被OVs（TDEVs@OVs）平臺。該技術將預感染OVs的腫瘤細胞加載到MN裝置的上層儲庫中，MN中間的聚碳酸酯膜可阻止腫瘤細胞通過，同時允許TDEVs@OVs持續釋放。此外，上層的乳膠彈性膜可提供持續的收縮力以促進TDEVs@OVs通過中空MN擴散。釋放的TDEVs@OVs能夠歸巢至同源癌細胞，同時減少DCs的非期望攝取。這種對癌細胞的高度選擇性細胞毒性以及有效防止DCs耗竭的能力，將增強DCs介導的T細胞免疫，并最大化OVs的免疫刺激潛力。此外，MN陣列可以促進藥物在腫瘤內的均勻分布，以克服腫瘤固有的物理屏障，從而增強OVs的抗腫瘤功效。

本研究開發了基于MN的原位TDEVs包被OVs平臺。將預感染OVs的小鼠肺癌細胞（TC-1）加載到中空MN中，TC-1外泌的TDEVs@OVs從MN裝置中釋放用于癌癥免疫治療。MN陣列由固定在有孔的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）底座上的不銹鋼中空微針組成。代表性MN貼片呈3×3陣列排列，每個針高度約1450微米，基底直徑310微米，內徑160微米。約3微米孔徑的聚碳酸酯膜的微孔結構通過掃描電子顯微鏡驗證。OVs儲庫由乳膠彈性膜封閉以增強細胞儲存能力，且該膜表現出優異的變形能力，便于TDEVs@OVs溶液的運輸。

動態光散射（DLS）和透射電子顯微鏡（TEM）用于表征OVs、TDEVs和TDEVs@OVs。裸露OVs和TDEVs的直徑分別為98.15 ± 1.13納米和83.88 ± 5.08納米，而TDEVs@OVs的直徑為114.97 ± 2.45納米。相比之下，TC-1細胞直徑超過10微米，這進一步支持了TDEVs@OVs可成功穿過聚碳酸酯膜，而TC-1細胞被有效隔離在中空MN上層儲庫中的前提。蛋白質印跡結果顯示，與純化的TDEVs相似，在TDEVs@OVs中也檢測到了生物標志物TSG101、CD9、CD81以及“別吃我”信號生物標志物CD47。為了進一步證明OVs被TDEVs包被，使用Cy5標記的CD9（TDEVs常見生物標志物）抗體標記TDEVs@OVs。免疫熒光染色顯示，在TDEVs@OVs中觀察到紅色CD9熒光與綠色OVs熒光的共定位。使用另一種生物標志物CD81也觀察到TDEVs與OVs的共定位，表明包被在OVs上的膜是TDEVs。為了進一步確認OVs與TDEVs的結構關聯，使用腺病毒特異性抗六鄰體抗體進行了免疫沉淀測定。結果顯示，高比例的裸露OVs被有效沉淀，而TDEVs@OVs組的沉淀效率顯著降低，表明病毒衣殼被TDEVs屏蔽。值得注意的是，用Triton X-100破壞TDEV脂質雙層后，抗六鄰體抗體對TDEVs@OVs的沉淀效率顯著增加，為OVs包裹在TDEVs內提供了強有力的生化證據。使用抗CD9和CD81抗體的流式細胞術分析進一步證明了OVs與TDEV標志物之間的強關聯性，表明大部分OVs呈CD9和CD81陽性，為OVs在TDEVs內成功包封提供了額外證據。

此外，通過CCK-8法評估了OVs預感染TC-1細胞的活力，表明低病毒劑量OVs預感染的TC-1細胞在48小時后未表現出顯著細胞死亡。將OVs預感染的TC-1細胞加載到MN中，并在室溫下孵育后通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）評估其活/死活力。結果表明，OVs預感染的TC-1細胞可在MN內存活48小時。而且，通過聚合酶鏈式反應（PCR）檢測到從MN釋放的OVs。當MN加載裸露OVs或劑量相當于10⁸pfu OVs的OVs預感染TC-1細胞時，兩者釋放的OVs量在約48小時時幾乎相同。

為了評估OVs對DCs的細胞毒性，首先將DC2.4細胞系與不同濃度的OVs共孵育。OVs對DCs顯示出顯著的細胞毒性。一致地，將從C57BL/6小鼠收集的骨髓源性樹突狀細胞（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells, BMDCs）與不同濃度的OVs共孵育，進一步探究OVs對BMDCs的細胞毒性能力。OVs對BMDCs也顯示出顯著的細胞毒性。然而，在骨髓源性巨噬細胞（Bone Marrow-Derived Macrophages, BMDMs）和脾源性CD3⁺T細胞中，相同濃度的OVs觀察到的細胞毒性很弱。此外，通過共孵育分泌的TDEVs@OVs或裸露OVs，評估了對BMDCs和TC-1細胞的細胞毒性能力。與OVs組相比，TDEVs@OVs處理組對BMDCs的細胞毒性降低，表明TDEVs@OVs保護了DCs免受OVs誘導的細胞死亡。相反，與OVs組相比，TDEVs@OVs處理組對TC-1細胞顯示出強大的細胞毒性能力，這表明從MN釋放的TDEVs@OVs具有選擇性細胞毒性能力。同時，采用抗CD47抗體阻斷實驗評估了TDEVs@OVs與裸露OVs對BMDCs和TC-1細胞的細胞毒性效應。CD47阻斷顯著增強了TDEVs@OVs對BMDCs的細胞毒性。相比之下，TDEVs@OVs對TC-1細胞的強細胞毒性效應未明顯改變，且仍顯著高于裸露OVs組。這些結果證實，TDEVs@OVs可通過“別吃我”信號機制保護DCs免受OVs誘導的細胞死亡。

進一步研究了從MN釋放的TDEVs@OVs的細胞攝取機制。結果表明，與裸露OVs組相比，TDEVs@OVs在BMDCs中的攝取顯著減少。相反，TDEVs@OVs在TC-1細胞中的攝取顯著增加。此外，進行了抗CD47抗體阻斷實驗以進一步驗證�？笴D47處理顯著增加了BMDCs對TDEVs@OVs的攝取。相比之下，TC-1細胞對TDEVs@OVs的攝取未受明顯影響，且仍顯著高于裸露OVs。這些發現與細胞毒性測定結果一致。此外，為了證明TDEVs@OVs在多細胞系統中的選擇性攝取能力，在體外建立了BMDCs-TC-1細胞共培養模型，通過流式細胞術評估OVs在BMDCs（CD45⁺CD11c⁺）和TC-1細胞（CD45^?CD11c^?）中的攝取效率。流式細胞術分析結果顯示，在裸露OVs處理組中，約64%攝取的OVs分布在BMDCs中，36%在TC-1細胞中；而在TDEVs@OVs處理組中，約20.2%的OVs被BMDCs攝取，79.8%被TC-1細胞攝取。結果進一步證實，TDEVs@OVs可增強TC-1細胞的攝取能力，同時逃避免BMDCs的攝取。

進一步在體外TC-1-BMDCs-CD3⁺T細胞共培養模型中評估了TDEVs@OVs促進DCs成熟和免疫激活的能力。將BMDCs與TC-1細胞共培養，并用從MN收集的裸露OVs或TDEVs@OVs處理。孵育24小時后，引入CD3⁺T細胞并再共培養48小時。隨后，收集共培養模型中的細胞進行流式細胞術分析。結果顯示，與裸露OVs相比，TDEVs@OVs在促進DCs（CD11c⁺CD80⁺CD86⁺）成熟方面表現出更大功效。此外，TDEVs@OVs處理組可激活CD8⁺T細胞，從而誘導腫瘤特異性T細胞免疫。而且，觀察到TDEVs@OVs可防止DCs耗竭，證據是BMDCs在BMDCs-TC-1細胞共培養模型中 prolonged 和持續分泌促炎細胞因子（IL-6和TNF-α）。

此外，為了探索MN陣列與單針注射OVs相比TDEVs@OVs的均勻分布，開發了含有腫瘤細胞的體外3D Matrigel模型模擬實體瘤。CLSM圖像顯示，MN通過其陣列結構促進了OVs更廣泛的分布，而基于單針的注射組則局限于 confined 空間。然后，在TC-1-hCD46異種移植瘤荷瘤小鼠中比較了瘤內注射和MN介導遞送后OVs的瘤內分布。CLSM圖像顯示，通過瘤內注射，OVs局限于注射區域。相比之下，MN處理組顯示出顯著的腫瘤浸潤。

在攜帶TC-1-hCD46腫瘤的C57BL/6小鼠異種移植瘤模型中探索了MNs (TDEVs@OVs)的溶瘤潛力。將荷瘤小鼠分為五組，分別通過瘤內注射接受特定治療：PBS、MNs (TC-1)、MNs (OVs)、OVs和MNs (TDEVs@OVs)。MNs (TC-1)治療未表現出顯著的腫瘤生長抑制。用MNs (OVs)和OVs治療的動物表現出中度的腫瘤生長抑制，而在MNs (TDEVs@OVs)治療組中觀察到TC-1腫瘤生長的顯著減少和生存期的延長。荷瘤小鼠的體重或主要器官的組織病理學檢查未觀察到顯著改變。肝腎功能指標，如丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、肌酐和血尿素氮，未表現出顯著變化。此外，評估了MNs (TDEVs@OVs)的長期安全性譜。C57BL/6小鼠在給藥30天后未表現出顯著的器官損傷或肝腎功能指標異常變化，證明了MNs (TDEVs@OVs)良好的安全性。此外，還測定了所有組別腫瘤中各種細胞因子的水平。對IL-1β、IFN-γ、IL-6、IL-12P70、TNF-α、IL-23和IL-27的定量表明，MNs (TDEVs@OVs)治療組中所有測試的細胞因子水平均升高。由于部分細胞因子主要由DCs分泌，如IL-6、IL-12P70、TNF-α、IL-23和IL-27，這進一步證實了基于MN的原位TDEVs包被OVs治療后有效防止了DCs耗竭并促進了適應性免疫應答。

DCs在連接腫瘤抗原與T細胞應答中起關鍵作用。成熟DCs表達高水平的共刺激分子如CD80和CD86，可促進T細胞增殖、分化和存活。本文采用免疫熒光法在TC-1-hCD46荷瘤C57BL/6小鼠模型中探索MN的免疫刺激潛力。用熒光標記抗體標記腫瘤樣本以評估CD11c⁺DC細胞和CD8⁺T細胞的浸潤。與對照組相比，在用MNs (TDEVs@OVs)治療的腫瘤中觀察到CD11c⁺DC細胞和CD8⁺T細胞的顯著流入。此外，通過流式細胞術在第三次治療后分析腫瘤內的成熟DCs（CD45⁺CD11c⁺CD80⁺CD86⁺），顯示MNs (TDEVs@OVs)治療組比例更高，表明用于激活腫瘤特異性T細胞的DCs募集和成熟增強。此外，腫瘤和脾臟中細胞毒性T淋巴細胞（CD45⁺CD3⁺CD8⁺）的流式細胞術分析顯示，MNs (TDEVs@OVs)組中CD8⁺T細胞增多，導致抗腫瘤應答增強。在MNs (TDEVs@OVs)治療組內觀察到調節性T細胞（CD45⁺CD3⁺CD4⁺FOXP3⁺）的顯著減少，表明免疫抑制條件的重塑。進一步分析涉及收集和檢查血液中的記憶T細胞（CD45⁺CD3⁺CD8⁺CD62L^?CD44⁺）以評估MNs (TDEVs@OVs)觸發的抗腫瘤免疫記憶效應。結果顯示MNs (TDEVs@OVs)組中記憶T細胞增多，展示了MNs (TDEVs@OVs)作為誘導持續長期免疫應答的有效方法所具備的強大免疫記憶保護。

基于上述免疫細胞介導的抗腫瘤免疫應答，進一步研究了MNs (TDEVs@OVs)對術后殘留腫瘤的治療效果。將攜帶TC-1-hCD46異種移植瘤的雌性C57BL/6小鼠分為五組。原發腫瘤體積達到400 mm³后，切除腫瘤，留下5%的殘留腫瘤塊以評估術后原發殘留腫瘤的復發情況，通過活體成像系統（IVIS）成像和游標卡尺監測。雖然用MNs(OVs)和OVs治療的動物能適度抑制腫瘤復發，但MNs (TDEVs@OVs)治療組在抑制腫瘤復發方面顯示出最佳能力。該組五只小鼠中有三只顯示檢測不到的腫瘤，而另外兩只顯示弱腫瘤復發。此外，在治療16天后接種 distant 腫瘤以模擬腫瘤轉移。結果顯示，用MNs (TDEVs@OVs)治療的組表現出最強的抗轉移功效。此外，在29天的過程中未觀察到體重的顯著波動�？傊�，MNs (TDEVs@OVs)的應用表現出高治療有效性和良好的生物安全性譜。

本研究描述了一個基于MN的原位分泌TDEVs包被OVs的平臺。將預感染OVs的TC-1細胞加載到中空MN上層儲庫的策略可以阻止腫瘤細胞通過，同時促進TDEVs@OVs的持續釋放。釋放的TDEVs@OVs表現出特異性靶向腫瘤部位癌細胞的能力。更重要的是，它們還能夠通過“別吃我”信號機制減少DCs的攝取。腫瘤微環境內對腫瘤細胞的選擇性細胞毒性有效防止DCs耗竭，以增強DC介導的T細胞免疫并最大化OVs的免疫刺激潛力。此外，MN陣列破壞了固有的物理屏障，促進了藥物在腫瘤區域內的均勻分布，進一步增強了MNs (TDEVs@OVs)的抗腫瘤功效。

盡管結果令人鼓舞，但關于安全性、普適性和臨床轉化的幾個方面值得進一步討論。首先，將活腫瘤細胞納入醫療器械引發了合理的安全擔憂，包括活腫瘤細胞潛在泄漏和繼發性腫瘤形成的理論風險。盡管當前設計包含了一個能有效保留細胞同時允許納米囊泡通過的聚碳酸酯膜，但在臨床應用前，嚴格的長期安全性評估（包括在生理條件下測試裝置完整性以及在免疫健全和免疫缺陷模型中進行致瘤性研究）將是必不可少的。未來的迭代也可以探索使用輻照或復制無能腫瘤細胞以進一步減輕任何殘留風險。

其次，雖然我們的平臺在TC-1-hCD46異種移植模型中顯示出顯著療效，但其在其他腫瘤類型和動物物種中的普適性仍有待確定。不同的癌癥表現出表面標志物的異質性表達，這可能影響OV趨向性和TDEV歸巢。采用一組癌細胞系和患者來源異種移植物的進一步研究，以及在更大動物模型（如兔或豬）中的測試，將有助于評估該方法的更廣泛適用性。此外，該平臺通過不同細胞外囊泡遞送其他治療 cargo（如細胞因子、siRNA或化療藥物）的多功能性值得探索。

第三，關于臨床轉化，我們的系統必須在良好對照的比較研究（如瘤內OV注射）中與現有標準療法進行評估。盡管我們的MN平臺在持續釋放和改善分布方面具有優勢，但可擴展性、制造重現性和無菌保證 presents 顯著挑戰。為TDEVs@OVs生產建立穩健的質量控制標準至關重要。此外，患者特異性因素如腫瘤可及性、皮膚厚度和免疫狀態可能影響治療結果，需要在臨床試驗設計中仔細考慮。

總之，基于MN的原位TDEV包被OV平臺代表了一種通過最小化脫靶免疫細胞毒性和促進適應性抗腫瘤免疫來增強溶瘤病毒治療的新策略。雖然當前的概念驗證數據令人鼓舞，但未來的工作應側重于解決上述安全性、普適性和可制造性挑戰。隨著持續優化和驗證，這種方法在增強癌癥免疫治療方面具有相當大的前景。

（此部分為實驗細節，主要包含材料來源、MN制備與表征、TDEVs分離、TDEVs@OVs表征、蛋白質印跡分析、BMDCs/BMDMs/CD3⁺T細胞分離、免疫沉淀測定、細胞活力測定、體外細胞攝取、體外共培養系統免疫激活能力評估、體內抗腫瘤效果評估、流式細胞術分析、抑制腫瘤復發和轉移效果評估以及統計分析等方法描述。具體實驗步驟和參數如前文所述，此處不再贅述。）