快速、靈敏且準(zhǔn)確的核酸生物標(biāo)志物檢測在疾病早期篩查、傳染病預(yù)防和術(shù)后監(jiān)測中具有重要意義（Azad和Chandra，2025；Lee等人，2015）。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，單一標(biāo)志物的檢測方法越來越無法滿足診斷需求。相比之下，同時檢測多個目標(biāo)可以提供更全面的樣本信息，提高分析效率并增加檢測準(zhǔn)確性（Behyar等人，2024；Li等人，2025b）。然而，傳統(tǒng)的多重檢測技術(shù)（如多重聚合酶鏈反應(yīng)、多重?zé)晒饷庖邷y定和多重核酸雜交）大多在單一系統(tǒng)中分別檢測每個目標(biāo)。隨著目標(biāo)數(shù)量的增加，所需的探針和試劑數(shù)量也隨之增加，這不僅增加了反應(yīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性，還增加了假陽性或假陰性的風(fēng)險（Purohit等人，2019；Reese等人，2024）。此外，這些單獨的檢測方法忽略了生物標(biāo)志物之間的內(nèi)在關(guān)系。疾病的發(fā)病和進展通常涉及多個標(biāo)志物或整個途徑的協(xié)調(diào)變化，而不僅僅是單個分子的孤立改變（Srivastava等人，2023；Tian等人，2024）。此外，這些變化并不總是均勻的，在某些情況下甚至可能是相反的。例如，miRNA 21和端粒酶在惡性非侵襲性細胞（如MCF-7和SK-BR-3）以及轉(zhuǎn)移性MDA-MB-231細胞中高度表達。相比之下，miRNA 31在非腫瘤細胞MCF-10A中表達最高，在MCF-7和SK-BR-3中顯著降低，在MDA-MB 231中幾乎不存在（Bai等人，2020）。因此，為了準(zhǔn)確解釋標(biāo)志物的動態(tài)并提高診斷測定的特異性和準(zhǔn)確性，開發(fā)新的檢測技術(shù)至關(guān)重要（Nandi等人，2025）。

DNA邏輯運算采用數(shù)字電路中的布爾邏輯原理，使用生物分子作為輸入信號。通過結(jié)合和鏈置換等分子相互作用，進行邏輯區(qū)分，從而產(chǎn)生特定的信號輸出（Zhu等人，2022）。這一過程不僅能夠分析多個輸入信號之間的內(nèi)在關(guān)系，還能減少試劑消耗，從而最小化信號干擾和非特異性反應(yīng)（Li等人，2025a）。目前，AND門邏輯電路的主流設(shè)計是在信號放大之前進行AND邏輯運算，這有助于確保檢測的特異性（Yan等人，2024）。然而，AND邏輯運算通常依賴于鏈置換，這一過程的動力學(xué)受到初始低豐度生物標(biāo)志物的限制（Bi等人，2024；Liu等人，2023）。因此，對于基于AND門的多個生物標(biāo)志物檢測來說，這一步成為限制因素。因此，開發(fā)一種信號放大在邏輯運算之前或同時發(fā)生的檢測策略可以顯著加快多個生物標(biāo)志物的檢測速度。

除了優(yōu)化傳統(tǒng)DNA電路架構(gòu)的努力外，探索新的信號生成方式也引起了極大的興趣。其中，規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）系統(tǒng)作為一種強大的信號生成工具，在快速核酸檢測中表現(xiàn)出色，例如Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing（SHERLOCK）（Kellner等人，2019）、DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter（DETECTR）（Broughton等人，2020）、One-Hour Low-cost Multipurpose highly Efficient System（HOLMES）（Li等人，2018）和FnCas9 Editor Linked Uniform Detection Assay（FELUDA）（Azhar等人，2021）等平臺。由于其操作簡單、可編程性和單堿基分辨率，基于CRISPR的檢測被視為下一代核酸檢測技術(shù)。盡管CRISPR系統(tǒng)的切割活性可以實現(xiàn)一對多信號放大，但這一過程并非無限可持續(xù)。隨著切割的進行，激活的Cas蛋白會逐漸發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致失活。因此，提高切割活性仍然是改進基于CRISPR的檢測的關(guān)鍵點之一。目前，有三種主要方法用于提高CRISPR/Cas系統(tǒng)的性能，包括工程化Cas蛋白（Yang等人，2023）、crRNA級聯(lián)（Sha等人，2021）和底物探針優(yōu)化（Rossetti等人，2022）。其中，工程化Cas蛋白相對復(fù)雜。結(jié)構(gòu)修飾，如結(jié)構(gòu)域交換或引入新的功能模塊，可能會損害Cas蛋白的原始結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而影響切割活性和特異性。在級聯(lián)CRISPR檢測中，上游反應(yīng)的產(chǎn)物作為下游Cas蛋白的特異性底物探針，從而提高信號（Sha等人，2021）。不幸的是，這種級聯(lián)過程是“弱耦合”的，即上游產(chǎn)生的信號會擴散到下一層，使得級聯(lián)放大效率低下且可選。通過底物探針優(yōu)化增強熱點是另一種有吸引力的方法（Rossetti等人，2022）。通過將底物探針固定在金納米顆粒上，可以增加局部熱點濃度，從而適度提高切割效率（Xu等人，2023）。然而，金納米顆粒對發(fā)射信號的熒光淬滅效應(yīng)可能會影響檢測的靈敏度。盡管已經(jīng)采取措施提高探針-Cas的親和力并減少載體引起的干擾（例如，使用自組裝的DNA四面體（Li等人，2023）或線性納米結(jié)構(gòu)（Liu等人，2019），但這些結(jié)構(gòu)上的探針負(fù)載能力仍然限制了可實現(xiàn)的熱點效果。

在這里，我們提出了一種環(huán)對環(huán)（C2C）AND邏輯電路，結(jié)合多腿crRNA（Mlegs）和立方體框架熱點（CFH）探針檢測方法，稱為C2C-Mlegs-CFH，用于同時檢測miRNA 122和miRNA 223。這兩種miRNA是肝細胞癌（HCC）中的腫瘤抑制基因，都與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）途徑相關(guān)（Dong等人，2014）。它們的下調(diào)促進了EMT過程，從而增強了癌細胞的侵襲性、轉(zhuǎn)移性和治療抗性（Jiang等人，2008）。在我們的設(shè)計中，這兩種miRNA的同時存在會觸發(fā)級聯(lián)C2C-滾動環(huán)擴增（RCA）反應(yīng)，形成分支RCA（bRCA）產(chǎn)物，然后激活Mlegs-Cas12a復(fù)合物。激活的Cas12a對CFH探針表現(xiàn)出增強的切割活性，產(chǎn)生放大的熒光信號。這種集成設(shè)計解決了多目標(biāo)miRNA檢測中的三個關(guān)鍵挑戰(zhàn)：（1）基于C2C的AND門電路將邏輯運算與信號放大獨特地結(jié)合在一起，克服了傳統(tǒng)AND門的動力學(xué)限制，確保了雙目標(biāo)的特異性。（2）Mlegs配置在空間上招募了多個Cas12a效應(yīng)器，大大提高了激活效率，從而提高了檢測靈敏度，而不影響特異性。（3）CFH探針作為一個密集包裝的納米結(jié)構(gòu)支架，為報告探針創(chuàng)造了局部熱點，有效放大了目標(biāo)特異性信號，同時抑制了背景噪聲。在對反應(yīng)條件進行系統(tǒng)優(yōu)化后，我們評估了所提出檢測方法的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。此外，我們使用該檢測方法在36個臨床樣本（18個來自HCC患者，18個來自健康對照組）中檢測了miRNA 122和miRNA 223，并將結(jié)果與逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）的結(jié)果進行了比較，從而驗證了其在未來臨床應(yīng)用中的潛力。

在這項工作中，我們建立了一個強大的生物傳感平臺C2C-Mlegs-CFH，用于同時檢測與HCC相關(guān)的miRNA。該系統(tǒng)旨在克服傳統(tǒng)邏輯運算中固有的速率限制問題，即信號放大在目標(biāo)識別之后進行，并提高Cas12a蛋白的切割動力學(xué)。

關(guān)鍵創(chuàng)新包括基于工程化CRISPR原理構(gòu)建的多腿crRNA，這加速了Cas12a的

郝江：撰寫——原始草稿、方法學(xué)、研究、概念化。楊俊元：撰寫——原始草稿、方法學(xué)。錢成：撰寫——原始草稿。李安怡：撰寫——原始草稿。劉穎：撰寫——原始草稿。張福清：撰寫——原始草稿。鄧玉林：撰寫——審閱與編輯、監(jiān)督。段金燕：撰寫——審閱與編輯、資源提供。呂學(xué)飛：撰寫——審閱與編輯、監(jiān)督、研究、概念化。

數(shù)據(jù)和材料將根據(jù)要求提供。

該研究方案已由中國解放軍總醫(yī)院的倫理委員會審查并批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號S2024-831-01，日期：2025.01.16）

作者聲明他們沒有已知的競爭性財務(wù)利益或個人關(guān)系可能影響本文報告的工作。