《International Journal for Parasitology》：NcROP24 loss attenuates
Neospora caninum virulence and alters rhoptry organization
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本研究針對新孢子蟲(Neospora caninum)致病機制不清的問題，通過CRISPR/Cas9技術構建NcROP24基因敲除突變體(NcΔROP24)，發現該蛋白缺失可顯著降低寄生蟲在孕鼠模型中的垂直傳播能力，改變宿主巨噬細胞的轉錄調控網絡，揭示NcROP24作為棒狀體效應蛋白在調控宿主-寄生蟲互作中的關鍵作用，為牛新孢子蟲病的疫苗研發提供新靶點。
在畜牧業領域，牛新孢子蟲病(Neosporosis)猶如一個隱形殺手，每年造成全球范圍內數十億美元的經濟損失。這種由專性細胞內寄生原蟲——新孢子蟲(Neospora caninum)引起的疾病，是導致奶牛流產和繁殖障礙的首要傳染性病因。新孢子蟲與著名的弓形蟲(Toxoplasma gondii)同屬頂復門(Apicomplexa)寄生蟲，它們共享類似的入侵機制和細胞內寄生策略。然而，與新孢子蟲相關的分子致病機制卻遠不如弓形蟲研究得深入。
問題的核心在于新孢子蟲如何成功地在宿主體內建立感染并逃避免疫清除。像許多頂復門寄生蟲一樣，新孢子蟲依賴于一套高度特化的分泌器官——微線體(micronemes)、棒狀體(rhoptries)和致密顆粒(dense granules)。其中，棒狀體蛋白(ROPs)在寄生蟲入侵宿主細胞的早期過程中發揮關鍵作用，它們像精準的分子武器，改造宿主細胞環境，壓制免疫防御，為寄生蟲創造安全的繁殖場所。盡管一些新孢子蟲棒狀體蛋白如NcROP2和NcROP40已被證明與毒力相關，但大多數棒狀體蛋白的功能仍然是個謎。
在前期研究中，科學家們注意到一個有趣的現象：在高毒力新孢子蟲分離株中，一個名為NcROP24的棒狀體蛋白表達水平顯著升高。更復雜的是，新孢子蟲基因組中竟然存在三個高度相似的NcROP24旁系同源基因(paralogs)，這引發了關于它們是否具有功能冗余或特異性作用的疑問。盡管轉錄組學數據表明這三個基因位點都有活性，但NcROP24在新孢子蟲致病過程中的具體功能至今未知。
為解開這一謎團，由Rafael Amieva領導的研究團隊在《International Journal for Parasitology》上發表了一項突破性研究，他們首次通過基因編輯技術揭示了NcROP24在新孢子蟲毒力中的關鍵作用。研究表明，缺失NcROP24會顯著削弱寄生蟲的致病能力，改變棒狀體結構，并重塑宿主細胞的轉錄程序，這些發現為理解新孢子蟲致病機制提供了新視角，也為開發抗新孢子蟲干預策略指明了新方向。
研究人員采用了幾項關鍵技術展開研究：利用CRISPR/Cas9基因編輯系統同時靶向三個NcROP24旁系同源基因，成功構建了NcROP24敲除突變體(NcΔROP24)；通過孕鼠模型評估寄生蟲的體內毒力和垂直傳播能力；采用牛單核來源巨噬細胞(BMDM)和牛滋養層細胞(F3)分析寄生蟲的體外增殖特性；運用雙RNA測序(dual RNA-seq)技術同時分析感染過程中宿主和寄生蟲的轉錄組變化；借助免疫膠體金標記和透射電鏡技術確定NcROP24的亞細胞定位。
研究結果從多個層面揭示了NcROP24的功能：
基因組分析確認了三個NcROP24旁系同源基因的存在。研究人員通過對高毒力分離株Nc-Spain7和低毒力分離株Nc-Spain1H進行基因組比對，證實了NCLIV_007450、NCLIV_068850和NCLIV_069590這三個位點確實存在，且在不同分離株中保持高度保守。RNA測序數據進一步顯示，這三個位點在野生型寄生蟲中均有轉錄活性，盡管表達水平存在差異。
NcROP24定位于棒狀體周邊區域。通過免疫膠體金標記和透射電鏡觀察，研究人員發現NcROP24主要分布在棒狀體的外周區域，而不是棒狀體核心或球部。這種定位特征提示NcROP24可能參與棒狀體膜的組成或作為分子支架調控其他效應蛋白的分泌。
成功構建并驗證了NcΔROP24敲除突變體。研究團隊設計了一種巧妙的策略，針對三個NcROP24旁系同源基因的保守區域設計向導RNA，通過CRISPR/Cas9系統同時破壞所有三個基因拷貝。通過PCR、qPCR和免疫熒光等多種方法驗證，確認獲得了四個獨立的NcΔROP24克隆，這些克隆中NcROP24蛋白表達完全缺失，且藥物篩選標記DHFR-TS為單拷貝整合。
NcROP24缺失顯著減弱寄生蟲在孕鼠模型中的毒力。在BALB/c小鼠先天性新孢子蟲病模型中，與感染野生型Nc-Spain7的母鼠相比，感染NcΔROP24的母鼠產下的后代存活率顯著提高（約25%存活至產后30天，而野生型組全部死亡）， median生存時間延長（16天vs21-22天），母鼠腦內寄生蟲負荷降低，臨床癥狀減輕。血清學分析還顯示，感染突變體的母鼠表現出更偏向Th1型的免疫反應（IgG1/IgG2a比率降低），這與有效的寄生蟲控制相關。
NcΔROP24在巨噬細胞中復制受損，但對干擾素-γ(IFN-γ)的敏感性未改變。在牛單核來源巨噬細胞中，NcΔROP24在感染后期（48-72小時）顯示明顯的復制缺陷，而在牛滋養層細胞F3中則復制正常。當用不同濃度IFN-γ處理感染的巨噬細胞時，野生型和突變體寄生蟲均顯示劑量依賴性的生長抑制，且程度相當，表明NcROP24缺失不影響寄生蟲對IFN-γ介導的免疫應答的敏感性，其復制缺陷可能與基礎性降解途徑的抵抗能力下降有關。
轉錄組分析揭示了NcROP24缺失對宿主-寄生蟲互作的多層次影響。雙RNA測序結果顯示，NcΔROP24感染的巨噬細胞與野生型感染的細胞在基因表達譜上明顯分離。特別值得注意的是，NcROP24缺失導致宿主細胞中與自噬(autophagy)、溶酶體生物發生和線粒體自噬(mitophagy)相關的基因表達下調，而與膽固醇穩態、脂肪酸代謝和應激反應相關的基因表達上調。轉錄因子活性分析顯示，與應激適應和代謝重編程相關的轉錄因子（如EHF、NFATC4）活性增強，而與穩態維持和分化相關的轉錄因子（如ERG、PAX6）活性降低。
從寄生蟲角度看，NcΔROP24突變體表現出組蛋白基因上調和其他毒力因子（如RDF2、ROP32、ROP40、GRA23）下調的轉錄特征，表明寄生蟲可能向壓力適應性狀態轉變，減少了攻擊性增殖。
比較聚類分析揭示了NcROP24特異性調控的宿主通路。當將NcΔROP24與先前研究的NcΔROP2突變體進行比較時，研究人員發現兩者均影響宿主細胞周期調控，但只有NcROP24缺失特異性下調了與細胞內運輸、自噬和溶酶體活性相關的基因模塊，這凸顯了NcROP24在調控宿主降解途徑中的獨特作用。
綜合所有實驗結果，本研究得出以下核心結論：NcROP24是新孢子蟲毒力的關鍵決定因子，其缺失會顯著減弱寄生蟲在體內的致病性和垂直傳播能力。在分子水平上，NcROP24定位于棒狀體周邊，可能作為分子支架參與調控棒狀體效應蛋白的分泌和功能。NcROP24的缺失導致寄生蟲無法有效重編程宿主巨噬細胞的轉錄網絡，特別是削弱了其對宿主降解途徑（如自噬和線粒體自噬）的抑制能力，同時增強了宿主的代謝應激反應，最終創造了一個不利于寄生蟲存活的環境。
這項研究的創新性在于首次系統闡明了NcROP24在新孢子蟲致病機制中的關鍵作用，揭示了該蛋白通過調控宿主降解途徑而影響寄生蟲存活的新機制。不同于大多數研究關注的催化活性強的棒狀體激酶，NcROP24作為一個可能缺乏典型催化活性的棒狀體蛋白，通過非酶活方式影響宿主-寄生蟲互作，這拓展了我們對頂復門寄生蟲效應蛋白功能多樣性的認識。
從應用角度看，NcROP24作為一個重要的毒力因子，可能成為抗新孢子蟲藥物或疫苗開發的新靶點。特別是考慮到NcΔROP24突變體在體內顯示顯著減毒但在體外培養中仍能存活的特點，提示其可能具有作為減毒活疫苗候選株的潛力。當然，這需要進一步在牛等自然宿主模型中驗證其保護效果和安全性。
研究的討論部分還指出了幾個值得深入探索的方向：首先，需要明確NcROP24的具體分子功能——它是作為支架蛋白參與其他效應蛋白的組裝，還是具有非典型酶活？其次，三個NcROP24旁系同源基因是否具有功能分工或冗余？此外，NcROP24如何與其他棒狀體蛋白協同工作，以及它在不同宿主細胞類型中的功能特異性，都是未來研究的重要課題。
總體而言，這項研究不僅深化了我們對新孢子蟲致病分子機制的理解，也為開發控制牛新孢子蟲病的新策略提供了理論依據和實驗基礎。隨著對NcROP24等功能分子機制的進一步解析，我們有望最終找到有效控制這種重要寄生蟲病的突破口，減少其對全球畜牧業的危害。
