《Food and Energy Security》：Maternal Haploid Induction Through Egg Cell-Specific Endopeptidases in Brassica napus: A Step Forward Towards Hybrid Fixation
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本文通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除甘藍(lán)型油菜中卵細(xì)胞特異性內(nèi)切蛋白酶基因（BnECS1/BnECS2），首次建立了母系單倍體誘導(dǎo)系統(tǒng)（HIR達(dá)0.29%-1.5%）。該研究為雜交固定（Hybrid Fixation）技術(shù)提供了關(guān)鍵支撐，可解決雜交后代倍性倍增難題，顯著加速作物育種進(jìn)程。
摘要
雜交固定技術(shù)能有效降低雜交種子的生產(chǎn)成本，但現(xiàn)有技術(shù)存在結(jié)實(shí)率低和倍性遞增等問題。本研究通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除甘藍(lán)型油菜的卵細(xì)胞特異性內(nèi)切蛋白酶基因（BnECS1和BnECS2），成功誘導(dǎo)母系單倍體產(chǎn)生。突變體雜交后代中單倍體誘導(dǎo)率（HIR）最高達(dá)1.5%，且單倍體植株表現(xiàn)出典型特征：植株矮小、葉綠體數(shù)量減半、氣孔尺寸縮小及雄性不育。該技術(shù)為甘藍(lán)型油菜雜交固定育種提供了新型工具。
引言
傳統(tǒng)雙單倍體技術(shù)受基因型依賴性限制，而體內(nèi)單倍體誘導(dǎo)系（HIL）可實(shí)現(xiàn)快速純合化。目前擬南芥、玉米等作物中已報(bào)道CENH3、DMP等多種單倍體誘導(dǎo)機(jī)制，但甘藍(lán)型油菜最高HIR僅2.5%。雜交固定植株雖能保持雜種優(yōu)勢，但連續(xù)自交會(huì)導(dǎo)致倍性倍增。卵細(xì)胞特異性內(nèi)切蛋白酶（ECS）在避免多精入卵的同時(shí)具備單倍體誘導(dǎo)功能，為解決上述問題提供了新思路。
材料與方法
以甘藍(lán)型油菜品種"Westar"為材料，通過同源比對鑒定出BnECS1（2個(gè)同源拷貝）和BnECS2（7個(gè)同源拷貝）。利用CRISPR-P網(wǎng)站設(shè)計(jì)gRNA，構(gòu)建pKSE401-GFP載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。通過Hi-TOM技術(shù)檢測突變類型，亞細(xì)胞定位顯示BnECS1/2均定位于細(xì)胞膜。采用流式細(xì)胞術(shù)、50K芯片重測序等技術(shù)鑒定單倍體，并觀察花粉活力、胚珠數(shù)量等表型。
結(jié)果
同源性與表達(dá)分析
系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示ECS基因在十字花科中高度保守。BnECS1在子房中高表達(dá)，BnECS2僅BnC03拷貝在生殖組織表達(dá)。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測表明突變導(dǎo)致提前終止密碼子（BnECS1-1：33aa；BnECS2-1：20aa）。
突變體構(gòu)建與表型
成功獲得Bnecs1（雙靶點(diǎn)突變41株）、Bnecs2（雙靶點(diǎn)突變4株）及雙突變體（55株）。突變體花粉活力無顯著變化，但胚珠數(shù)顯著減少（野生型26±1個(gè)，突變體21±1個(gè)）。qPCR證實(shí)突變體中樞基因表達(dá)量顯著下調(diào)。
單倍體誘導(dǎo)效率
Bnecs1突變體HIR為0.57%-1.5%，雙突變體降至0.29%-0.46%，Bnecs2未誘導(dǎo)出單倍體。SSR標(biāo)記和基因組重測序證實(shí)單倍體僅攜帶母本遺傳背景。單倍體葉綠體數(shù)量（約15個(gè)/保衛(wèi)細(xì)胞）顯著少于二倍體（約30個(gè)），氣孔密度更高但尺寸更小。
討論
BnECS1介導(dǎo)的母系單倍體誘導(dǎo)具有獨(dú)特優(yōu)勢：①不依賴父本誘導(dǎo)系；②可解決雜交固定植株倍性倍增問題；③與溫度調(diào)控聯(lián)用有望提高HIR。與已報(bào)道的DMP/GIG1等父本誘導(dǎo)系統(tǒng)相比，該技術(shù)為育種提供了新路徑。
結(jié)論
本研究首次在甘藍(lán)型油菜中建立ECS介導(dǎo)的母系單倍體誘導(dǎo)系統(tǒng)，為雜交固定育種提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。未來通過機(jī)制解析和溫度優(yōu)化，有望進(jìn)一步提高誘導(dǎo)效率并應(yīng)用于倍性調(diào)控。
