研究首先建立了一套實時監測腸道上皮細胞頂膜表面pH的方法。利用健康供體（HL）和囊性纖維化（CF，ΔF508純合突變）患者的直腸類器官衍生單層，研究人員比較了在不同頂膜溶液（含碳酸氫鹽的Krebs-Ringer緩沖液KRB、Tris-NaCl溶液、無緩沖NaCl溶液）下的表面pH動態變化。在穩態條件下，CF類器官的表面pH（7.23 ± 0.03）顯著低于健康類器官（7.34 ± 0.03）。使用Tris-NaCl這種碳酸氫鹽-free且初始pH為中性的溶液，可以有效排除低pH對碳酸氫鹽分泌的刺激，從而直接測量上皮細胞的碳酸氫鹽分泌能力。研究發現，細胞具有強大的能力，無論初始條件如何，都能在數小時后建立一個恒定的穩態表面pH。在達到穩態后，基底外側加入福斯高林（forskolin）刺激，能在所有條件下引發類似的碳酸氫鹽分泌反應，表現為表面pH立即上升并在約2小時后達到平臺期。這表明腸道上皮細胞在體外生理條件下維持表面pH穩態的能力非常 robust。

SLC26A3（DRA）和CFTR在結腸上皮沿隱窩-表面軸的表達模式不同。DRA在表面上皮表達最高，向隱窩基部逐漸降低，而CFTR在隱窩基部表達最高。為了闡明它們在人類大腸中的獨特生理功能，研究使用了來自健康（HL）和囊性纖維化（CF）供體的直腸類器官。這些類器官被工程化為表達極低基礎水平DRA的載體對照（veh），或在Tet-On啟動子控制下過表達flag標記的DRA（DRA-OE），同時保持內源性CFTR表達。

表面pH調節動力學研究表明，在Tris-NaCl條件下，CF對照類器官與HL對應物相比，顯示出顯著降低的初始碳酸氫鹽輸出和表面堿化速率。值得注意的是，DRA-OE顯著提高了HL和CF樣本的初始表面堿化速率，使HL和CF類器官之間的反應均等化。達到穩態后，CF對照培養物的表面pH顯著低于HL培養物。然而，CF_DRA-OE培養物也表現出增加的堿化速率，并達到與HL_DRA-OE培養物相當的表面pH水平。福斯高林刺激在所有培養物中誘導了表面堿化，但CF_veh樣本的堿化速率和穩態表面pH顯著減弱。使用KRB緩沖液作為頂膜溶液的平行實驗產生了非常相似的結果，盡管由于溶液中預先存在的碳酸氫鹽而無法監測初始堿化速率。重要的是，所有實驗組的穩態和福斯高林刺激的表面pH值在Tris-NaCl和KRB條件之間驚人地一致。

研究還擴展到人類結腸類器官培養物。對照結腸類器官培養物維持的穩態表面pH（6.92 ± 0.05）明顯低于直腸類器官，但與我們之前表征的Caco-2單層相當。使用10 μM CFTR_inh172抑制CFTR會導致對照結腸類器官表面顯著酸化（ΔpH ~0.8）。盡管存在這種酸化，福斯高林刺激的碳酸氫鹽分泌在CFTR抑制的結腸類器官中基本保持完整。DRA-OE即使在CFTR抑制下也能維持類似對照的穩態表面pH。值得注意的是，DRA-OE培養物在福斯高林刺激后表現出快速的表面堿化，無論CFTR狀態如何，在刺激后的第一次測量中就達到了最大反應。盡管在未分化的結腸類器官中基礎DRA表達極低，但DRA敲除（DRA-KO）培養物與載體對照結腸類器官相比，顯示出適度但統計學上顯著的穩態表面pH降低，證實即使這種低水平的內源性DRA也有助于基礎碳酸氫鹽分泌。此外，DRA-KO培養物對福斯高林刺激的反應與對照培養物相比顯著減弱，表明DRA活性是結腸類器官中最大cAMP刺激的碳酸氫鹽分泌所必需的。

結腸類器官和直腸類器官培養物之間不同的穩態pH譜和對CFTR功能障礙的不同反應表明，與CFTR和DRA相關的表面pH調節機制在這些模型中可能有所不同。盡管如此，兩種模型都表明，在缺乏DRA功能的情況下，CFTR缺陷會嚴重損害上皮碳酸氫鹽分泌能力，導致生理條件下穩態表面pH降低。增強的DRA功能可以有效地補償由CFTR缺陷引起的碳酸氫鹽輸出減少，在穩態下促進表面堿化達到與健康對照相當的水平，并恢復對福斯高林的反應性。

CFTR的陰離子輸出在調節腸道上皮流體分泌中起著既定作用。因此，研究調查了DRA與CFTR共表達是否影響CFTR介導的陰離子輸出和上皮流體分泌。

CFTR缺陷在腸道類器官中的一個特征性形態學特征是管腔萎縮且形狀偏心。在DRA-OE后，研究人員觀察到與載體CF對照相比，CF類器官的圓度有所改善，這是由于管腔體積增加所致。定量分析證實，CF類器官的偏心值顯著高于HL類器官。引人注目的是，DRA-OE降低了CF類器官的偏心度，但增加了HL類器官的偏心度，這些相反的效應最終減小了DRA-OE CF和DRA-OE HL類器官之間的偏心度差異，表明在穩態條件下通過DRA-OE使CF類器官形態正常化。

使用福斯高林誘導腫脹（FIS）試驗研究激動劑刺激的流體分泌與CFTR和DRA功能的關系。在HL直腸類器官中，福斯高林刺激誘導進行性擴張，在60分鐘內歸一化面積增加至基線約180%。HL類器官中的DRA-OE使初始腫脹速率（ISR）提高了約50%，但60分鐘后的累積腫脹與對照相比無顯著差異。形成鮮明對比的是，CF直腸類器官在整個觀察期間對福斯高林刺激沒有反應。CF類器官中的DRA-OE不影響這種腫脹缺陷。

為了進一步研究結腸上皮中的這些動力學，研究人員對結腸類器官培養物進行了類似的實驗，并增加了使用10或50 μM濃度的CFTR_inh172進行藥理學CFTR抑制。對照結腸類器官表現出強勁的福斯高林誘導腫脹，在60分鐘后實現約200%的歸一化面積擴張。DRA-OE似乎增加了ISR和累積腫脹，但與載體對照相比，這些差異未達到統計學顯著性。在10 μM CFTR_inh172時，載體對照和DRA-OE結腸類器官僅顯示腫脹參數適度降低，在50 μM抑制劑濃度下，兩種模型均顯示ISR和總體腫脹顯著下降。

這些發現表明，DRA共表達對福斯高林誘導的CFTR陰離子輸出及其 consequent 流體分泌在結腸和直腸上皮中影響極小。CF直腸類器官表現出福斯高林誘導腫脹的完全消失，而10 μM CFTR_inh172對結腸類器官腫脹的影響可忽略不計，即使在50 μM升高濃度下也僅產生部分抑制。CFTR_inh對腸道流體分泌或離體黏膜（與單層培養物相比）短路電流反應的抑制效果減弱以前經常被觀察到，可能是由于物質存在擴散屏障。類似的情況可能存在于嵌入細胞外基質的三維類器官中。

研究人員通過Using chamber電生理測量進一步評估了DRA和CFTR在陰離子轉運中的功能相互作用。HL直腸類器官單層對順序添加1.25和5 μM福斯高林表現出強勁反應。添加10 μM福斯高林和IBMX僅產生 modest 額外效應。DRA-OE單層表現出相似的反應，與載體對照相比，CFTR介導的電流沒有顯著增強。用CFTR_inh172抑制CFTR消除了所有條件下的福斯高林誘導電流，并消除了組間差異，證實觀察到的分泌反應是CFTR依賴性的。隨后添加UTP和布美他尼（bumetanide）產生最小效應，組間無顯著差異，表明CFTR抑制后鈣激活氯通道或其他NKCC1依賴的轉運機制貢獻可忽略不計。

CF直腸類器官表現出對所有測試福斯高林濃度的嚴重受損陰離子分泌反應，與其CFTR功能障礙一致。值得注意的是，CF類器官中的DRA-OE不能恢復或顯著改善福斯高林誘導的電流，表明增強的DRA表達不能影響有缺陷的CFTR陰離子轉運。

這些發現證明，DRA表達不增強人類腸道上皮中CFTR介導的陰離子分泌。這些發現與先前在異源表達系統中報道的DRA介導的強勁CFTR激活形成對比。這種差異的一個原因可能是，在內源性陰離子攝取途徑低表達或缺如的情況下，通過異源表達的CFTR激活Cl^-外流可能誘導SLC26A3介導的Cl^-攝取。然而，在腸道上皮中，基底外側陰離子攝取機制（NKCC1, AE2）維持細胞內氯可用性。已有研究表明，在鯊魚直腸腺（其頂膜表達CFTR）中，Cl^-分泌的限速因素是基底外側Cl^-攝取。同樣，頂膜CFTR依賴的HCO₃^-分泌取決于基底外側陰離子攝取轉運體的表達和細胞內HCO₃^-的生成。優雅的實驗和數學模擬表明，人類和豚鼠胰液中高HCO₃^-濃度是由于基底外側Cl^-攝取機制表達低，這導致CFTR刺激后細胞內Cl^-濃度非常低，并增加了CFTR通道的HCO₃^-通透性。相比之下，小腸絨毛區域的CFTR高表達細胞以及小腸和結腸隱窩和絨毛基底的細胞表達NKCC1、NBCs和AE2，未分化的人源類器官也是如此。相比之下，小腸和結腸隱窩區域的未分化細胞以及小腸中的Best4陽性CFTR高表達細胞不表達DRA。最近對人類小腸類器官的研究表明，僅由分化絨毛細胞組成的類器官只有在表達不表達DRA的Best4陽性CFTR高表達細胞時才會向其管腔分泌液體。因此，CFTR和DRA在人類腸道中的共定位可能僅限于過渡放大細胞和成熟吸收性腸細胞之間的過渡區細胞。

黏液黏稠癥（mucoviscidosis）和CFTR缺失小鼠中的CFTR功能障礙與杯狀細胞增生、黏蛋白脫顆粒缺陷以及上皮表面存在黏稠黏液相關。研究人員采用免疫熒光共聚焦顯微鏡比較HL和CF直腸類器官模型作為載體對照或DRA-OE的黏蛋白分泌。

使用MUC2抗體和UEA1凝集素染色可視化類器官內的細胞內黏蛋白顆粒。由于類器官培養物未分化，杯狀細胞相對稀少。這些產黏蛋白細胞頂膜側強烈的鬼筆環肽（phalloidin）信號表明它們主要是非經典杯狀細胞。

在健康直腸類器官中，MUC2免疫染色顯示黏蛋白顆粒沿分泌途徑在細胞核和頂膜之間廣泛分布。相比之下，CF類器官顯示出顯著改變的黏蛋白分布模式，其特征是更大、更密集的MUC2陽性顆粒，在細胞的頂膜下區室豐度降低。

值得注意的是，DRA-OE顯著改善了CF類器官中的黏蛋白分布，導致MUC2分布模式擴展，在頂膜下和頂膜細胞區室中的存在增強。UEA1染色產生了類似的結果。MUC2信號分布的定量分析證實，DRA-OE顯著影響CF直腸類器官中的細胞內黏蛋白分布。

其背后的分子機制需要進一步研究，但可能涉及pH依賴的黏蛋白包裝和分泌。杯狀細胞分泌顆粒內的黏蛋白包裝已被證明是pH和鈣依賴的。此外，CF腸類器官培養物中杯狀細胞的黏蛋白顆粒與野生型培養物相比保持異常堿性pH，而在我們的實驗中，通過誘導CF直腸類器官中的DRA恢復碳酸氫鹽外流，可能糾正了這種pH失衡。在小鼠結腸隱窩的隱窩口細胞中，slc26a3^-/-結腸細胞的細胞內pH顯著比WT更堿性，證明了DRA作為結腸細胞堿排出器的重要功能。

本研究證明了CFTR和更重要的是SLC26A3（DRA）陰離子交換體獨立地堿化結腸表面pH。在具有高內源性功能性CFTR表達或非功能性F508突變蛋白的人結腸類器官中，誘導異源DRA表達導致同樣高的表面堿化速率。相反，CFTR的陰離子和流體分泌活性不受DRA表達誘導的顯著影響。此外，DRA表達無法挽救F508突變類器官中的流體分泌缺陷。然而，DRA表達使F508突變類器官中的高偏心度和異常黏液顆粒分布正常化，可能通過其作為結腸細胞主要堿排出器和pH調節劑的作用。總之，DRA挽救了CF突變結腸細胞中部分而非全部異常細胞生理學。DRA和CFTR的陰離子轉運功能在天然結腸細胞中主要相互獨立。