《Advanced Science》：Label-Free Molecular Characterization of Protein Aggregates in Differentiated Astrocytes
編輯推薦：
本文創新性地運用時間分辨中紅外光熱顯微鏡技術，實現了對分化星形膠質細胞微域的無標記、多參數表征。研究首次在亞微米尺度上同步揭示了細胞突起中α-螺旋蛋白的富集特征（與非分化細胞β-片層為主的結構形成對比），并通過光熱擴散測量發現分化細胞突起界面存在更高的熱阻。該技術為解析星形膠質細胞分化機制及其在腦穩態（如AQP4/TRPV4/VRAC通道功能）和病理狀態（如阿爾茨海默病、癲癇）中的結構-功能關聯提供了全新視角。
引言
腦生理過程涉及中樞神經系統內離子和分子的跨細胞運動。星形膠質細胞作為神經膠質細胞，通過其終足表達的離子和水通道微域在調節腦穩態中起關鍵作用。關鍵膜蛋白通道包括水通道蛋白4（AQP4）、瞬時受體電位香草素4超家族（TRPV4）鈣通道和容積調節性陰離子通道（VRAC）。這些膜蛋白的結構和功能特性改變會破壞細胞功能，導致阿爾茨海默病、多發性硬化癥、癲癇、膠質瘤和缺血等慢性疾病。體外研究星形膠質細胞機制的一個主要問題是，經典細胞培養模型中的膜蛋白特化微域與體內觀察到的不同。先前研究表明，在基于水滑石類化合物（HTlc）的納米結構界面上培養的大鼠原代星形膠質細胞在體外發生分化，表現出體內星形膠質細胞的分子和功能特性。然而，目前缺乏將這些蛋白質的結構與功能特性相關聯的信息。
當前用于關聯這些蛋白質結構和功能的工具包括X射線晶體學、透射電子顯微鏡和核磁共振波譜。雖然這些方法對結構測定非常寶貴，但并未提供蛋白質結構與功能之間關系的完整圖像。中紅外光熱成像是一種強大的無標記模態，可以在分子指紋區域（3-12 μm）以亞微米空間分辨率提取豐富的化學和結構信息。這使得能夠研究生物樣本中的蛋白質二級結構，因為中紅外振動共振峰取決于主鏈構象，例如酰胺I帶的情況。然而，雖然之前已用該技術定位結構信息，但尚未證明與此類細胞域的功能特性（包括熱擴散動力學）直接相關。時間分辨光熱顯微鏡是該技術的最新進展之一，通過測量光熱信號的加熱和擴散瞬態動力學，提供了對吸收特性的補充信息。
在這項工作中，我們使用時間分辨和多光譜光熱成像來同時提取星形膠質細胞微域的熱擴散以及分子特性。我們在傳統聚-D-賴氨酸（PDL）基質上培養的原代大鼠新皮質星形膠質細胞（通常保持未分化和多邊形形狀）和在HTlc上培養的星形膠質細胞（為在體外驅動星形膠質細胞分子和功能分化提供了有效且生物相容的平臺）上進行分析。
多模塊化中紅外光熱顯微鏡
光熱顯微鏡系統基于振動紅外光熱和相位信號成像，由較短波長的探測激光與作為泵浦的脈沖量子級聯激光器組成，其可調發射 targeting 特征振動共振。利用熱透鏡效應，可以實現中紅外特征的亞衍射極限化學成像，空間分辨率約為750 nm。可以直接進行熒光和光熱振幅信號圖像的交叉配準。時間分辨光熱圖像通過盒式car檢測系統在單次測量中獲得，以便在超時間圖像堆棧中可視化加熱和熱擴散動力學。
通過調諧泵浦的發射波長進行多光譜振幅和熱擴散成像。為了解未分化和分化星形膠質細胞之間的結構和功能差異，我們分析和比較了在標準玻璃蓋玻片上涂覆PDL或滴鑄HTlc納米顆粒薄膜培養的原代皮質星形膠質細胞。星形膠質細胞突起的形成允許比較未分化星形膠質細胞和分化星形膠質細胞的結構和功能。當在HTlc基質上生長時，PTS細胞成像揭示了分化細胞域中獨特的化學、結構和功能特征，這些在PDL細胞中未發現。通過分析酰胺I帶內的蛋白質，細胞質的結構形狀揭示了HTlc細胞分化星形膠質細胞特有的星狀延伸。對于PDL細胞，分辨出圓形細胞質。或者，靶向核酸中磷酸基團的PO4鍵，可以看到與集中在細胞核區域的核酸相關的高信號。因此，我們的混合光熱顯微鏡系統可以繪制化學含量以及熱擴散特性圖，并結合熒光顯微鏡用于交叉配準目的。
分化星形膠質細胞的多光譜光熱成像揭示其突起的α-螺旋組成
在酰胺I帶峰值處，分化HTlc細胞的PTS圖像顯示從主細胞體延伸的突起。通過調諧泵浦發射，我們研究了與酰胺I帶中存在的不同二級蛋白構象相關的波數處的相對信號貢獻，特別是β-片層以及α-螺旋蛋白。β/α圖像顯示，在HTlc上生長的星形膠質細胞突起包含較低的β/α比值<0.9，而細胞體中存在β/α值超過1的局部化域。從HTlc細胞收集的代表性光譜顯示，在突起處收集的光譜在1640 cm-1處有峰值，β/α值為0.77。在較高β/α值域收集的光譜顯示酰胺I峰明顯紅移至1626 cm-1，導致β/α比值為1.5。通過二階導數分析結合光譜解卷積識別了個別二級蛋白貢獻，對于在星形膠質細胞突起收集的光譜，發現β-片層和α-螺旋的相對百分比分別為47%和21%，另外還有31%來自無規卷曲。
相比之下，在PDL基質上生長的細胞呈多邊形形狀。PDL細胞在酰胺I帶峰值的PTS圖像顯示。β/α比值顯示出更空間均勻的分布，值接近甚至超過0.9。在細胞體收集的酰胺I光譜相當寬，在α-螺旋和β-片層結構相關的波數處有高峰，β/α ≈ 0.9。同樣，解卷積分析顯示，對于未分化細胞，β-片層的貢獻幾乎翻倍，高達79%。總體而言，PDL細胞細胞體的平均β/α值確定為約0.96 ± 0.07，而HTlc細胞突起的平均β/α值為0.78 ± 0.09。這種增加被發現具有統計學顯著性。此外，光譜解卷積顯示，HTlc細胞突起處的α-螺旋含量平均值約為40%，這是在PDL細胞細胞質中發現的含量的2.6倍，后者平均值為15%。同樣，據報道β-片層含量增加了1.8倍，平均值從HTlc細胞突起的45%增加到PDL細胞細胞質的85%。還值得注意的是，僅在選定的HTlc細胞突起中發現了無規卷曲二級蛋白結構，但在PDL細胞細胞質中的貢獻始終低于3%。
β-片層含量的增加導致酰胺I光譜帶變寬。來自7個PDL細胞細胞質和7個HTlc細胞突起的平均歸一化光譜顯示，非α-螺旋蛋白構象的高貢獻，主要包括β-片層，導致酰胺I光譜峰變寬。每個細胞的酰胺I光譜下的面積顯示，PDL細胞細胞質的平均光譜面積為81.7 ± 5.3 V·cm-1，比HTlc細胞突起的相應平均光譜面積66.9 ± 2.7 V·cm-1大約1.3倍。
盒式car時間分辨光熱成像揭示分化星形膠質細胞細胞突起界面熱擴散時間較未分化細胞細胞質慢
除了分子形態，HTlc細胞突起界面的熱擴散動力學可以用我們的具有盒式car功能的光熱成像系統表征。在擴散窗口期間的代表性圖像顯示HTlc細胞突起界面和PDL細胞細胞質界面。表征熱擴散速率的1/e時間衰減常數τ的二維 mapping 表明空間異質性，特別是在HTlc細胞突起界面，觀察到較大的時間衰減常數。從HTlc細胞突起中心高信號區域選擇的10個點的平均瞬態曲線與從HTlc細胞突起界面兩側收集的10個等距點的平均瞬態曲線一起繪制。界面處的衰減常數明顯較慢，比中心慢1.5倍。總體而言，對于來自4個HTlc細胞的5個細胞突起的研究，在細胞突起中心收集的信號的衰減常數通常小于細胞突起界面處的衰減常數，表明細胞突起界面處熱阻增加。對于PDL細胞細胞質界面的瞬態動力學，等效時間衰減圖像中顯示時間衰減常數τ的均勻分布。類似地，從細胞體高信號區域選擇的10個點的平均瞬態曲線以及穿過細胞質界面的10個點的平均瞬態曲線顯示。界面與細胞體動力學表現出相似的行為，表明不存在較高的界面熱阻效應。后者行為也在另外三個PDL細胞中呈現。
研究擴散特性為表征分化和未分化星形膠質細胞提供了一種新方法。從4個不同HTlc細胞的5個HTlc細胞突起界面收集的50個點的平均時間軌跡以及從4個不同PDL細胞的細胞質界面收集的點的平均時間軌跡顯示，HTlc細胞突起界面的衰減常數慢1.8倍，τd-HTlc-interface= 1.93 μs > τd-PDL-interface= 1.03 μs。
PDL細胞細胞質的總體τ值，包括界面和中心區域，落在τd-PDL= 1.2 ± 0.2 μs的范圍內。HTlc細胞突起的時間衰減常數在界面處比過程中心區域大。因此，對于HTlc細胞突起，時間衰減分布更廣且更不均勻，標準偏差大1.7倍，總體平均值大1.3倍，為1.6 ± 0.3 μs。沿星形膠質細胞界面分布的時間衰減常數平均值τd-HTIc-interface= 1.8 ± 0.5 μs，比PDL細胞細胞質相關的平均τ大1.4倍。超過50%的來自過程界面的數據落在比PDL細胞數據集中發現的平均時間衰減常數大一個標準偏差的范圍內。
討論
在這項研究中，利用時間分辨中紅外多光譜光熱顯微鏡確定了分化細胞中星形膠質細胞突起的化學、結構和功能特性。首先，星形膠質細胞突起和未分化星形膠質細胞胞體之間二級蛋白結構的差異可能與星形膠質細胞終足形成的微域中特異性存在的膜蛋白聚集體有關。例如AQP4，這是在星形膠質細胞終足中發現的主要哺乳動物水通道膜蛋白。細胞內水含量的變化可直接影響細胞內離子和信號分子的濃度，導致細胞活性和細胞間通訊的改變。為了維持穩態，細胞采用調節性體積減少和調節性體積增加等機制，包括離子進出細胞的運動，這有助于恢復穩定狀態。水通道蛋白在細胞體積調節、神經興奮、信號傳遞、突觸可塑性中起關鍵作用，并參與大腦內的神經發生、細胞遷移和能量代謝。每個AQP4單體由六個跨膜α-螺旋結構域組成，基本上是一個被六個α-螺旋包圍的桶狀結構，β-片層存在很少。星形膠質細胞中的AQP4在生理上以四聚體聚集體形式表達，稱為正交粒子陣列。這些OAPs在星形膠質細胞終足的錨定取決于AQP4 C末端和α-輔肌動蛋白的直接相互作用，后者將AQP4連接到抗肌萎縮蛋白相關蛋白復合物和底層細胞骨架。這種極化定位對于AQP4有效支持星形膠質細胞功能至關重要。
另一個重要的膜蛋白是TRPV4，這是一種多模式傳感器，可被熱應激、細胞體積變化和質膜上的各向異性挑戰激活。在皮層中，TRPV4主要表達在靠近血管的星形膠質細胞膜上，并介導滲透誘導的鈣信號。氯離子和有機滲透劑通過VRAC的外流對于在RVD過程中恢復生理細胞體積至關重要。TRPV4的跨膜區主要由六個螺旋組成，β-片層存在顯著較少。考慮到星形膠質細胞微域在體內跨膜區的重要性，預見研究這些簇結構和功能的方法。
先前研究表明，將星形膠質細胞接種在HTlc納米結構薄膜上可促進星形膠質細胞的體外形態分化，這伴隨著AQP4、Kir4.1、TRPV4介導的鈣信號以及VRAC的滲透誘導氯離子電流表達和功能的上調。值得注意的是，細胞通過RVD和RVI響應滲透挑戰的能力也得到了改善。然而，雖然觀察到了這些功能結果，但迄今為止，對分化誘導的結構和構象蛋白修飾的了解甚少。
通過目前的工作，我們利用酰胺I帶對主鏈蛋白構象的敏感性填補了這一空白。發現分化細胞中的星形膠質細胞突起具有更強的α-螺旋蛋白積累，β/α比值約為0.78 ± 0.09，光譜解卷積顯示α-螺旋和β-片層含量的平均值分別約為41%和45%。在主要細胞體內部也發現了β-片層的局部簇。未分化細胞具有更大的蛋白構象多樣性，包括邊界和細胞體內高含量的β-片層，β/α比值約為0.96 ± 0.07。光譜解卷積還顯示，未分化細胞的β-片層含量接近5.6倍大，平均α-螺旋含量低2.7倍。這也通過它們比星形膠質細胞突起更大的酰胺I光譜帶總面積得到證實。這些結果支持了體外星形膠質細胞突起微域中存在α-螺旋蛋白聚集體的原則。
僅在分化星形膠質細胞中觀察到的α-螺旋和無規卷曲構象的共存表明分化依賴的結構異質性增加。這可能反映了膜通道（包括AQP4亞型）、細胞骨架重組子和內在無序調節蛋白的上調。在富含α-螺旋內容的區域中無規卷曲區域的富集可能反映了一類混合支架或膜-細胞骨架連接蛋白，結合了結構剛性和允許星形膠質細胞突起動態重塑的柔性元件，α-輔肌動蛋白是招募其他蛋白質的一個例子。此外，主要是α-螺旋的跨膜蛋白，包括AQP4和GFAP，也包含無序區域。相比之下，PDL細胞中缺乏這種特征可能反映了更緊湊和穩定的蛋白質組，具有更少的部分折疊或無序域。
在未分化星形膠質細胞胞體中觀察到的更寬的酰胺I特征可能與具有非α-螺旋二級結構的蛋白質有關，包括調節膠質細胞分化的生長因子如TGF-β。F-肌動蛋白是構成細胞骨架的另一個突出蛋白質，其子域中同時包含α-螺旋和β-片層結構。然而，從單個絲到更多束狀和交聯絲，α-螺旋與β-片層域的百分比各不相同。二維紅外光譜研究發現，強結合的F-肌動蛋白的特征是β-片層含量減少，而中紅外光誘導力顯微鏡研究已證明單個非交聯絲具有更寬的酰胺I特征。大鼠和人類細胞分化星形膠質細胞突起中存在的F-肌動蛋白是束狀肌動蛋白應力纖維的例子，其取向具有高度同質性，而未分化PDL細胞中存在的F-肌動蛋白其特征是取向多樣性更高。應當指出，分化和未分化細胞之間觀察到的結構差異可能受膜微域局部重組的影響，因此不一定反映整個蛋白質組中從α-螺旋到β-片層結構的全局轉變。因此，膜蛋白（占蛋白質總量的25-30%）與膜相關蛋白質額外局部和部分結構重排成微域的結合可以導致觀察到的光譜位移。
細胞邊界處F-肌動蛋白結構的差異自然導致功能特性的差異，包括與HTlc細胞較硬突起相比，PDL細胞質界面處更強的肌動蛋白動力學和更高的機械可塑性。HTlc細胞較低的增殖率也支持這一點。當暴露于溫度梯度時，肌動蛋白絲表現出沿絲取向的單向滑動，作為熱傳遞的途徑。因此，PDL界面中較高的絲取向多樣性可以為熱傳遞提供更多途徑，并可以解釋觀察到的比HTlc細胞突起更快的擴散時間。此外，蛋白質二級結構可以影響熱傳遞動力學，分子模擬強調了振動壽命的差異，以及β-桶狀蛋白由于振動能量傳遞過程中較大的平均自由程而具有較高的熱擴散率值。在HTlc細胞突起中發現的α-螺旋膜蛋白也比β-桶狀蛋白更具疏水性，這一特性可以降低與更親水界面相比的熱導率。
所有上述表明，與PDL細胞細胞質相比，HTlc細胞突起中界面熱阻增加，這由總體2.5倍較慢的衰減常數證明。
后一數據可能與HTlc上星形膠質細胞滲透水、鉀和氯離子的改善能力以及響應和平衡各向異性挑戰或鉀濃度升高的能力一致。
事實上，我們可以假設，α-螺旋豐富的膜蛋白，如AQP4和TRPV4，以及它們通過抗肌萎縮蛋白相關蛋白復合物聚集成高度有序的微域，可能與星形膠質細胞的穩態和代謝功能直接相關。事實上，AQP4、Kir4.1和TRPV4通過輔肌動蛋白在體內血管周圍終足的極化定位支持水和離子穩態，這對神經元代謝支持至關重要。另一方面，缺乏血管周圍輔肌動蛋白會改變體內星形膠質細胞的鉀和水滲透性，導致在低鈉血癥等病理條件下腦水腫形成較慢。類似地，分化星形膠質細胞中膜蛋白復合物的結構組織可能反映了它們在神經發育過程中準備和實現大腦中代謝、信號和支持作用的能力。
結論
總體而言，我們證明了時間分辨中紅外多光譜光熱顯微鏡將化學蛋白質結構識別與熱動力學表征相結合的獨特能力。該技術應用于星形膠質細胞成像，揭示了其突起中的主要蛋白質二級結構及其相關的熱擴散特性。這種無標記成像工具是研究星形膠質細胞分化機制以及星形膠質細胞微域蛋白質組裝在健康或病理狀態（如膠質瘤或癲癇，其中星形膠質細胞微域的結構和功能已知受損）中作用的一種新方法。星形膠質細胞是非常可塑的細胞，其形態在神經發育的不同階段或作為損傷的結果以及響應突觸活動而改變。通過將蛋白質復合物水平的結構重排與星形膠質細胞的已知功能能力聯系起來，我們的方法在分子結構和生理相關性之間架起了橋梁，表明分化相關的蛋白質組重組可能有助于并伴隨多種星形膠質細胞功能的獲得。
發育中的中樞神經系統中的未成熟星形膠質細胞支持神經元成熟并具有干細胞樣特性。成熟星形膠質細胞部分喪失這些功能，但獲得對成人中樞神經系統穩態至關重要的新功能。后一功能不限于離子和水穩態，還包括神經元的代謝支持。在病理條件下，星形膠質細胞變得“反應性”，這破壞了它們成熟的穩態功能，并重新激活一些未成熟星形膠質細胞樣特性，表明星形膠質細胞成熟的部分逆轉。
在這方面，未來對星形膠質細胞整體和邊界之間差異的深入分析可能揭示與星形膠質細胞對腦功能營養和代謝支持的眾所周知作用相關的結構/功能相關性。盡管如此，考慮到屬于不同腦區的星形膠質細胞的異質性，我們期望這里報告的結果強調了我們方法的可行性，以提供指紋和簽名來分類和闡明這些細胞的多樣性及其在神經發育、神經病理條件或星形膠質細胞與納米材料界面相互作用中的作用。
