《Advanced Science》：Modulating Purothionin Accumulation and Signal Peptide Cleavage Fine-Tunes Wheat Flour Gluten Properties to Improve Cookie-Making Quality
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本研究通過鑒定小麥低面筋蛋白突變體lgp2，揭示其由α-2-硫素蛋白（LGP2）信號肽切割位點錯義突變引發內質網應激，導致蛋白體形成異常和面筋網絡弱化。該發現不僅闡明硫素蛋白通過與貯藏蛋白互作參與面筋形成的新機制，更提出通過調控信號肽加工（SP cleavage）和LGP2表達的雙重遺傳策略，為培育適用于低面筋食品（如餅干）的專用小麥品種提供了新思路。
引言：小麥餅干品質的挑戰與機遇
小麥作為全球主要糧食作物，其加工品質直接影響面制品的特性。與需要強面筋的面包不同，餅干制作需要弱面筋特性以保障酥脆口感。然而，現有軟麥品種的濕面筋含量常超過餅干生產標準（<25%），制約了優質餅干專用麥的選育。雖然通過修飾高分子量谷蛋白亞基（HMW-GSs）和γ-醇溶蛋白（如LGP1）可調控面筋，但關鍵基因資源的缺乏限制了育種進展。
lgp2突變體的表型特征：弱面筋網絡的發現
研究團隊通過EMS誘變軟麥品種魯麥15，篩選出低面筋蛋白突變體lgp2。該突變體成熟籽粒中HMW-GSs和醇溶蛋白積累減少，而低分子量谷蛋白亞基（LMW-GSs）增加。發育時序分析顯示，lgp2種子中HMW-GSs從8天授粉后（DAP）起積累顯著低于野生型。面團離心實驗表明突變體無法形成完整面筋網絡，僅出現類似面筋的松散物質。共聚焦顯微鏡觀察進一步揭示lgp2面團蛋白區域減少、網絡連接點減少，呈現更多孔隙和不規則結構，證實其面筋網絡凝聚力減弱。
LGP2基因的圖位克隆與功能驗證
遺傳分析表明lgp2性狀受單基因控制。通過圖位克隆將候選基因定位到染色體1D上206.6 kb區間內的TraesCS1D02G405700，命名為LGP2。該基因編碼α-2-硫素蛋白，其第80位核苷酸G→A突變導致信號肽（SP）切割位點處甘氨酸（Gly27）變為天冬氨酸（Asp）。免疫印跡檢測發現lgp2中存在比野生型大2-3 kDa的LGP2蛋白條帶，瞬時表達實驗證實突變導致信號肽切割失敗。通過Prime Editing將栽培品種Fielder的LGP2-1DG編輯為LGP2-1DA，以及在不同遺傳背景（魯麥15、京411、鄭麥50）的回交群體中，均重現了低谷蛋白表型，驗證了該點突變的因果性。
未加工信號肽引發內質網應激與蛋白體異常
信號肽切割失敗導致突變型LGP2在內質網（ER）累積。電鏡觀察發現lgp2胚乳細胞中出現環狀和腫脹的粗糙內質網結構，而野生型為連續的片層結構。免疫電鏡證實LGP2定位于ER腔。與ER應激分子伴侶BiP的表達上調相印證，轉錄組分析顯示lgp2中BZIP50、ERDJ3A、BIP4等11個ER應激相關基因顯著上調。半薄切片和高壓冷凍電鏡顯示lgp2的蛋白體（PB）尺寸減小、形態不規則，表明貯藏蛋白積累受阻并非轉錄水平調控所致。
突變體籽粒硬度增加的機制探究
成熟lgp2籽粒硬度顯著高于野生型，掃描電鏡顯示其淀粉顆粒與蛋白基質結合緊密。盡管硬度相關基因Pina和Pinb的轉錄無差異，但其蛋白水平在突變體中下降。亞細胞定位表明PINs定位于ER，推測ER應激可能引發其降解。基因編輯和過表達株系均重現硬度增加表型，證實LGP2突變通過影響PINs積累間接改變籽粒質地。
硫素蛋白參與面筋形成的新功能
免疫電鏡顯示LGP2富集于蛋白體內。面團組分分離實驗發現LGP2特異存在于面筋組分中。酵母雙雜交和雙分子熒光互補（BiFC）實驗證明野生型和突變型LGP2均能與LMW-GS、γ-醇溶蛋白、α-醇溶蛋白互作。通過CRISPR/Cas9敲低LGP2的三個同源基因（lgp2-aabbdd和lgp2-AAbbdd株系），導致濕面筋和蛋白含量顯著下降。相反，在水稻中異源表達LGP2-1DG可提高籽粒蛋白含量，證實硫素蛋白通過二硫鍵參與面筋網絡構建。
lgp2面粉的餅干制作性能評估
餅干制作實驗表明，lgp2面粉所制餅干表面裂紋更均勻深刻，感官評價在裂紋、口感、質地方面得分更高，內部結構更細膩。但受籽粒硬度增加影響，餅干直徑和延展比降低。突變體還呈現A型淀粉顆粒比例增加、B型顆粒幾乎缺失、淀粉含量下降，以及千粒重、粒長和粒寬減少等農藝性狀變化，表明品質改良伴隨一定產量代價。
討論與展望：雙重遺傳策略的應用潛力
研究提出兩種遺傳改良策略：一是靶向信號肽切割位點（如LGP2突變），通過誘發ER應激間接弱化面筋；二是直接調控硫素蛋白表達（如基因敲低），精細調節面筋量與質。與導致嚴重ER應激和50%產量損失的LGP1突變相比，lgp2的產量損失較小（回交后僅8%），更具育種應用潛力。未來可通過多背景選育優化產量，或利用Prime Editing精準調控LGP2二硫鍵數量，進一步拓展面筋強度可調小麥的選育路徑。
本研究首次揭示硫素蛋白在面筋形成中的關鍵作用，為低蛋白小麥育種提供了新靶點，特別適用于餅干等低面筋食品及特殊醫學用途食品的開發。
